烟草脱水素基因NtDEH1的克隆及研究

罗　岸,詹　领

(1.长江大学 生命科学学院,湖北 荆州　434023;2.武汉大学 生命科学学院,湖北 武汉　430072)



烟草脱水素基因NtDEH1的克隆及研究

罗岸1,詹领2

(1.长江大学 生命科学学院,湖北 荆州434023;2.武汉大学 生命科学学院,湖北 武汉430072)

摘要：为研究脱水素在植物早期胚胎发育中的作用和机理，采用显微操作技术获得烟草卵细胞并构建其cDNA文库，从中筛选到一个脱水素基因NtDEH1。通过RACE技术获得该基因全长，基因组测序结合生物信息学分析表明该基因拥有一段长度为651 bp的完整开放阅读框和一段535 bp的内含子，编码由217个氨基酸残基组成的蛋白质，其理论等电点为5.27，属于酸性蛋白，且具有一定的亲水性。氨基酸序列比对分析发现在许多物种比如绒毛状烟草、林烟草、甜辣椒、番茄、马铃薯和丹参中都具有与NtDEH1蛋白非常类似的保守的同源序列，均具有SK2型脱水素特征。借助Genome walking技术获取NtDEH1基因约1 706 bp的5′侧翼序列，使用小叶烟草瞬时表达系统检测到其具有较强的启动子活性。该研究为进一步了解脱水素基因NtDEH1在植物生殖发育中的具体功能打下基础。

关键词：烟草;脱水素;基因克隆;NtDEH1;启动子;卵细胞

在高等植物的整个生命周期里可能会遇到多种多样的非生物胁迫,其中细胞缺水是较为常见的一种。因此，植物细胞为了抵抗干旱、低温和高盐胁迫引起的缺水状况,会应激产生一系列亲水性蛋白来维持其自身的正常生理代谢活动[1]。由于最初发现的这类蛋白在棉花胚胎发育的晚期表达,所以被称之为LEA蛋白(Late embryogenesis abundant)。此后在许多植物中也都陆续发现了LEA蛋白的同源蛋白[2]。这类蛋白均包含一段富含甘氨酸的序列和无序的蛋白质二级结构,同时都具有高度的亲水性,所以研究者按照这类蛋白的序列特征将所有的LEA蛋白分为3种类型[3],分别为LEA group1型、LEA group2型和LEA group3型。

其中LEA group2蛋白又被称为脱水素[4],通常在处于脱水状态的种子中大量表达,另外在干旱、低温和高盐胁迫下的营养器官中也会大量表达。因此,脱水素高量且广泛的表达是植物应对干旱胁迫的有效手段[5-7]。当然在植物的正常生长过程中,营养组织中也可以检测到脱水素的表达。这些结果暗示脱水素可能对植物的生长发育和抗逆性均具有重要意义[8-9]。脱水素存在于多种生物种类中,从高等植物到较为低等的单细胞生物[9-11]。这些脱水素蛋白根据其所包含的保守片段的特点可以为五类:YnSKn型、YnKn型、SKn型、Kn型和KnS型。这5种类型的脱水素在植物正常生长和抗逆过程中承担着不同的功能。Koag 等[12]发现YSKn型脱水素倾向于与含有酸性磷脂的脂质小泡相互结合。Hara等[13-14]发现KnS 型脱水素倾向于与金属离子相互结合,以消灭胞内游离的羟基并参与维持与低温应激相关的酶类的活性。而Arora和Lopez[15-16]发现SKn 型和Kn型脱水素主要参与抗寒与抗旱。

本研究首次在烟草的卵细胞cDNA文库中发现了一种SK2型脱水素基因,其在卵细胞中有大量转录本存在,该基因被命名为NtDEH1。本研究利用RACE技术获得NtDEH1基因的cDNA 全长序列,并通过染色体步移技术获得了该基因的5′ 侧翼序列(启动子和5′UTR)。小叶烟草瞬时转化证实新获得的NtDEH1基因的5′ 侧翼序列具有较强的启动子活性。这些研究为进一步探究烟草NtDEH1基因在卵细胞的发生、形成和受精前后的角色及功能打下了坚实基础。

1材料和方法

1.1试验材料

1.1.1菌株与质粒在pCAMBIA 1302载体上接入3×eGFP绿色荧光蛋白和NLS核定位信号序列将其改造为启动子活性检测载体。大肠杆菌感受态购自北京全式金公司。

1.1.2植物材料本试验使用的植物材料为红花烟草(Nicotianatabacumvar.SR1),24 ℃恒温种植,16 h/8 h光照周期。

1.1.3主要试剂基因克隆相关试剂采购自北京全式金公司。少量细胞RNA提取试剂使用购自Life technologies公司的Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit 试剂盒。cDNA扩增试剂使用购自Life technologies公司的SMARTer® Pico PCR cDNA Synthesis Kit试剂盒。

1.2试验方法

1.2.1烟草卵细胞的分离与cDNA pool的构建酶解未受精的胚珠3 h后,用微针剥离出50个烟草卵细胞[ 17]。少量细胞的RNA提取依赖于Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit 试剂盒。反转录得到的cDNA使用SMARTer® Pico PCR cDNA Synthesis Kit试剂盒扩增得到卵细胞cDNA pool。

1.2.2NtDEH1基因cDNA序列的克隆和5′侧翼序列的获得武汉大学孙蒙祥课题组已使用未受精的胚珠构建了RACE文库。用已经获得的卵细胞cDNA文库中存在的NtDEH1基因的EST序列进行5′和3′端RACE扩增。之后使用烟草Genome walking文库获得该基因的5′侧翼序列。按照RACE和Walking genome试剂盒说明书的要求设计所需要的特异性引物,并按照说明书所要求的反应体系和反应条件进行试验,引物见表1。

表1　RACE、Genome walking和CDS检测引物

1.2.3NtDEH1-eGFP核定位表达载体的构建依照获得的5′侧翼序列设计扩增NtDEH1基因的5′侧翼区的引物,并设计引物5′端的双酶切位点,引物PRO-F:5′-nnnnGAATTCAGTGCCAGAACGATTACCC CG-3′;PRO-R:5′-nnnnTCTAGACTTGTTGCTAAGAA CAAAGCAAAG-3′。使用PRO-F/PRO-R在烟草基因组中扩增NtDEH1基因的5′侧翼序列(启动子和5′UTR)。双酶切获得的目的条带,然后连入启动子活性检测载体。

1.2.4NtDEH1基因5′侧翼序列活性的检测使用注射小叶烟草法将连接有NtDEH1基因5′侧翼序列的启动子活性检测载体导入小叶烟草叶片下表皮。温室中放置40~48 h后将被转化叶片背面的叶表皮撕下,在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况。

1.2.5生物信息学分析使用Omiga软件进行核酸序列分析。使用Protparam在线网站进行NtDEH1蛋白的基本理化特性分析。使用Photoshop软件和CorelDRAW软件进行图像处理。使用Mega和ClustalX软件进行氨基酸序列的进化分析。

2结果与分析

2.1烟草卵细胞的分离

被子植物大孢子的发育过程深埋于子房组织中,通常难以直接进行观察研究。不过植物雌配子的形态相对较大,一般使用切割或酶解等方式破碎胚珠,通过显微操作分离得到雌配子。图1-A显示分离出的烟草卵器,包含了形态完整的中央细胞、卵细胞和2个助细胞。利用微针轻柔吸打和剥离可以分离出胚囊中不同类型的细胞,包括卵细胞(图1-B)。显微镜视野中的卵细胞形态完好,具有大的液泡,且没有母体组织粘连。证明其符合进行少量细胞RT-PCR检测的要求,可参与后续试验过程。

2.2烟草NtDEH1基因的克隆

使用烟草未受精胚珠制作的RACE文库,通过RACE技术获取了NtDEH1基因的完整3′端,但5′端扩增没有得到延伸。通过ORF分析发现已知序列含有一个651 bp的开放阅读框。在卵细胞cDNA中进行RT-PCR检测可以扩增得到该基因的CDS(图2-A),使用同样的引物在基因组中扩增该基因,发现其中包含一个长度为535 bp的内含子(图2-A，B)。运用Genome walking技术获取了NtDEH1基因的5′侧翼序列,包括5′UTR区和启动子区,总长1 706 bp(图2-A),在基因组上回扩验证,发现该基因及其启动子可以一同被扩增出(图2-A)。运用BlastX分析发现其与诸多物种的脱水素基因类似(图2-C)。

A.烟草卵器,箭头表示卵细胞,标尺=10 μm；

A.NtDEH1基因的克隆;1.在基因组中扩增基因及5′侧翼序列;2.在基因组中扩增基因5′侧翼序列;3.在基因组中扩增CDS;

2.3NtDEH1蛋白一级结构预测分析

使用Protparam软件对NtDEH1蛋白的氨基酸序列进行分析。表2中的结果表明,NtDEH1蛋白的多肽链由217个氨基酸组成,分子量约为2.460 5 kDa。多肽链包含有18 种基本的氨基酸类型,但不含半胱氨酸和色氨酸。其中谷氨酸和赖氨酸的含量最为丰富,各占有23.5%和20.7%。此外预测结果表明,NtDEH1蛋白的理论等电点为5.27,应属于酸性蛋白,且具有一定的亲水性。

2.4NtDEH1蛋白同源序列比对与 进化分析

利用BlastX 搜索烟草NtDEH1蛋白的同源序列,在绒毛状烟草(Nicotianatomentosiformis)和林烟草(Nicotianasylvestris)中发现了非常同源的蛋白序列。 由于二倍体野生烟草绒毛状烟草和林烟草是异源四倍体普通烟草的祖先种,因此,发现高度同源蛋白符合预期结果。而在甜辣椒、番茄、马铃薯、丹参等农作物中也都存在与NtDEH1蛋白类似的蛋白序列,其中烟草与甜辣椒的同源序列比烟草与同属茄科的番茄和马铃薯的同源序列在进化树上更接近(图3)。同时可以看出,虽然在木本棉和拟南芥中也有类似同源蛋白,但是在进化上与NtDEH1蛋白相距较远。

表2　NtDEH1蛋白一级结构预测分析

对除了拟南芥和木本棉的其他物种中NtDEH1蛋白的氨基酸序列进行比对,发现这些序列都极其保守,这可能与其脱水素特性有密切关系。脱水素具有保守的K片段(EKKGIMDKIKEKLPG),通常位于氨基酸序列的C末端,2个片段能形成双亲性α螺旋。在普通烟草、绒毛状烟草、林烟草、甜辣椒、番茄、马铃薯和丹参中均有此特殊的标志性序列。另外,在这些同源序列中还存在一个可能的核定位信号,即S片段(连续的6个丝氨酸残基),这些都符合Close 等所拟定的脱水素分类方法中SK2型脱水素的特点:即含有一个S片段和2个K片段(图4)。

图3　NtDEH1同源蛋白的系统进化树

图4　NtDEH1同源蛋白氨基酸序列比对分析

2.5NtDEH1基因的5′侧翼序列的启动活性

利用已知的NtDEH1基因的cDNA序列在基因组上借助Genome walking技术获得了长度约1 706 bp的5′侧翼序列。为了验证其启动活性,使用小叶烟草瞬时表达系统进行检测。将扩增的5′侧翼序列连入含有核定位信号和GFP荧光信号的启动子活性检测载体中。载体经农杆菌转化后被注入小叶烟草叶片,2 d后观察。图5表明瞬时转化的叶片中核定位信号非常强烈,这暗示该段5′侧翼序列具有较强的启动子活性。因此,本研究所获得的5′侧翼序列可启动基因的表达,能用于后续试验。

A.叶肉细胞明视野;B.叶肉细胞中GFP核定位荧光;C.GFP荧光和明视野叠加,标尺=20 μm.

3结论与讨论

在面临干旱、寒冷和高盐胁迫时植物中的脱水素会大量表达以应对细胞的脱水反应。而此时脱水素的表达范围也会比在非逆境下更广泛。例如经低温处理后的拟南芥脱水素蛋白的表达范围由非低温状态下的根尖扩展至全植株[18],野生马铃薯和大麦中的脱水素蛋白也具有相似的表达特点[2,19]。 车前叶玄参的脱水素蛋白经过干旱胁迫后会在全植株表达,而不是正常状态下仅在种子、根和叶子中表达。同样番茄的脱水素蛋白经过高盐胁迫后表达范围也逐渐扩展[20]。这些试验结果证明脱水素对于植物的正常生长发育和抗逆性极其重要。而众多的转基因株系都表明过表达脱水素能赋予植株更强的抗逆性[21]。利用脱水素的这种特性对于农业的增产增收能提供非常有力的帮助。因此,目前关于脱水素的研究基本集中于其在植物的营养发育时期及种子成熟过程中起的作用,以及其作用机理和表达模式等。

本研究成功地从烟草卵细胞中分离得到了一个脱水素基因NtDEH1,基因全长651 bp,编码217个氨基酸。通过Blast比对分析序列,发现在许多物种比如绒毛状烟草、林烟草、甜辣椒、番茄、马铃薯和丹参中都具有与之非常类似的同源序列。新发现的脱水素按照分类应属于SK2型。借助染色体步移技术获得了该基因的5′侧翼序列,通过瞬时转化证实其具有较强的启动子活力。不同于之前脱水素的表达模式,NtDEH1基因在卵细胞中大量表达,这是首次在烟草卵细胞中发现脱水素基因的存在。因此,今后可通过RNAi技术和定点突变技术来了解该脱水素基因对烟草卵细胞形成、发育乃至受精的重要影响,可以进一步丰富脱水素在植物体内的功能、作用机理与表达模式。

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Cloning and Analysis of Dehydrin GeneNtDEH1 inNicotianatabacum

LUO An1,ZHAN Ling2

(1.College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou434023,China;2.College of Life Science,Wuhan University,Wuhan430072,China)

Abstract：To study the function and mechanism of dehydrin in early embryogenesis of plant,egg cells were isolated from tobacco to construct a cDNA library,and a gene named NtDEH1 were found.The full sequence of NtDEH1 were obtained by RACE,genome cloning and bioinformatics analysis showed that NtDEH1 included a 651 bp CDS region and a 535 bp intron.NtDEH1 which contained 217 amino acids were hydrophilic and acidic,the theory isoelectric point was 5.27.The amino acid homology of NtDEH1 compared Nicotiana tabacum to Nicotiana tomentosiformis,Nicotiana sylvestris,Capsicum annuum,Solanum tuberosum,Solanum lycopersicum and Salvia miltiorrhiza showed that NtDEH1 homologous sequences in all these species were conserved and belonged to SK2type.5′ flanking sequence of NtDEH1 gene was also obtained by genome-walking,and the promoter activity of 5′ flanking sequence was checked by transient gene expression.The result laid a foundation in researching the role of NtDEH1 gene in plant reproduction.

Key words:Tobacco;Dehydrin;Gene cloning; NtDEH1;Promoter;Egg cell

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.012

中图分类号：Q942.1;S572.03

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)01-0071-06

作者简介：罗岸(1984-),男,湖北荆州人，讲师，博士，主要从事植物生殖发育生物学研究。

基金项目：长江大学自然科学基金项目(2014NSFY023)

收稿日期：2015-11-10