实验教学改进：血药浓度法估算家兔口服对乙酰氨基酚药动学参数

谢宝刚　刘爱红　赵天生　赖小平



实验教学改进：血药浓度法估算家兔口服对乙酰氨基酚药动学参数

谢宝刚1刘爱红2赵天生3赖小平3

【摘要】血药浓度法估算口服对乙酰氨基酚药动学参数是我校药学专业生物药剂学与药物动力学课程主要的实验内容之一。本文就给药后取血、样品前处理及血药浓度测定方法对原实验进行了改进。结果表明，相对于原实验方法，改进后的实验操作简便、取血顺利；利用差示分光光度法测定血药浓度可提高分析方法灵敏度，减少干扰因素。改进后的实验方法操作行强，具有较好稳定性和重现性，适合实验教学。

【关键词】教学改进；血药浓度法；药代动力学实验；差示分光光度法

【中图分类号】G642

【文献标识码】A

作者单位：1 330006南昌大学药学院；2 330006南昌大学分析测试中心；3 330006南昌大学医学实验教学部

生物药剂学与药物动力学是是药剂学的分支学科，是药学专业的主干专业课程之一，由生物药剂学与药物动力学两部分组成，其中，生物药剂学是研究药物及剂型在体内的吸收、分布、代谢与排泄（ADME）过程，阐明药物的剂型因素、机体生物因素和药物疗效之间相互关系的科学；药物动力学是应用动力学的原理与数学处理方法，定量描述药物通过各种途径进入机体的ADME过程的动态变化规律的科学。药物动力学方法广泛应用于制剂研究和药物质量评价、临床用药和新药筛选等方面，是一门实践性很强的课程。生物药剂学与药物动力学实验课的教学目的是使学生更好地掌握基本理论，培养学生的动手能力、发现问题及解决实际问题的能力，以提高学生的综合素质[1-3]。但药物动力学实验涉及生物药剂学、药物分析、药理学和统计学等多学科知识，实验操作复杂、影响因素多，可能导致实验结果与预期差距较大，存在实验效果不理想的情况[4-5]。血药浓度法估算口服对乙酰氨基酚药动学参数是药学相关专业主要的实验内容之一，对学生理解并掌握通过血药浓度的测定来获取药物的药动参数具有重要指导意义。该实验内容包括血样的采集、血药浓度的测定及实验数据处理等步骤。桂卉等[6]改进了该实验血清除蛋白方法，操作简便，适合学生教学实验。然而，在学生实验的带教过程中，发现该实验还存在取血不方便；测得的血药浓度数据波动范围大、误差偏大等现象，最终导致无法较好拟合药动学参数的缺陷。本文就该实验在家兔取血和血药浓度测定等方面对原实验方法进行了改进，改进后的实验方法重现性、稳定性好，适合学生教学实验，具体报道如下。

1　原实验主要步骤和方法[6]

家兔灌服对乙酰氨基酚片0.5 g后，采用耳静脉取血，对血样加氢氧化钡、硫酸锌除蛋白或1.5倍乙腈除蛋白的方法，离心后采用紫外分光光度法在257 nm测定血药浓度，然后进行数据处理：绘制药时曲线、将测得的血药浓度代入药动公式求算消除速率常数K、半衰期t1/2等药动参数。实验内容包括血样的采集、血药浓度的测定及实验数据处理三部分内容。其中对取血和给药后血药浓度的测定是本实验的实验课应完成的操作，药动学参数估算可以在实验完成后撰写实验报告时获得。

2　改进后的实验方法

2.1器材与试剂

仪器与材料：分析天平、容量瓶、751分光光度计、注射器每组2支、动脉夹、三通管、止血钳、眼科手术剪、具塞试管、10 ml离心管每组8个、家兔固定箱、刀片、棉球、离心机，1.0 ml及0.2 ml移液枪每组各一把。药品与试剂：扑热息痛（原料药）、2.5%戊巴比妥、无水或95%乙醇、0.02 M NaOH、肝素钠 1 mg/ml等。

2.2药浓度标准曲线的制备

取一只兔子，耳静脉取血大约3.0 ml，放置30 min后3 500 rpm离心10 min，得到无药血清。分别精密吸取对乙酰氨基酚标准贮备液（4 mg/ml，水箱保存）0.3 ml、0.60 ml、1.2 ml、1.8 ml、2.5 ml、3.0 ml于10 ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，分别得到120、240、480、720、1 000、1 200 μg/ml的标准溶液，再分别精密吸取上述标准溶液0.3 ml至6支离心试管中，加兔血清0.2 ml，振摇均匀，加2.5 ml乙醇，震荡摇匀，3 500 rpm离心10 min，每管取上清液2份，每份0.5 ml，其中一份准确加水4 ml （共4.5 ml），另一份加0.01 M NaOH 4 ml （共4.5 ml）。最后溶液于751型分光光度计上λ＝265 nm处分别测得不同溶液稀释样品的吸收率（A水和ANaOH），由将所测得的吸收度△A---C作图，进行回归分析，得到工作曲线。

2.3药动实验家兔取血、处理

取家兔一只，体重2～3 kg，雌雄均可，给药前禁食12 h。腹腔注射戊巴比妥 2.5%1.2 ml/kg进行麻醉。药物起效后，固定家兔，使其颈部拉直。剪毛，割皮，镊子、止血钳钝性分离颈总动脉。远心端结扎，近心端用动脉夹夹紧，留一根丝线备用。刀柄垫起动脉，小剪刀平剪开一斜口，用充满肝素钠的三通管进行动脉插管。动脉插管后，家兔导管灌胃对乙酰氨基酚原料药0.5 g/只（加1.5 ml水配成混悬剂）。给药后，按20、30、50、70、90、120、150、180、210、250、300 min，定时从动脉插管取血1.0 ml（先放掉大约1.0 ml管中含肝素的血）。将每次所取血液滴于预先干燥的刻度离心管中。待所有样品收集完后，全血3 500 rpm／min离心10 min。用移液枪精密吸取血清（上清）0.2 ml置离心管中。

2.4血药浓度的测定及动力学参数求算

上述血清0.2 ml，再加蒸馏水0.3 ml（总体积0.5 ml），加2.5 ml乙醇，震荡摇匀，3 500 rpm离心5 min，每管取上清液2份每份1.0 ml，其中一份准确加水4 ml（共4.5 ml），另一份加0.01 M NaOH加水4 ml（共4.5 ml）。最后溶液于751型分光光度计上，λ=265 nm处测得样品的吸收率，记录数据。

2.5数据处理

将各时刻下测得的吸收度△A值代入标准曲线上的回归方程，计算出各时刻下的血药浓度C（μg/ml）。以血药浓度C为纵坐标，时间为横坐标，作LogC-t曲线图。求出K，t1/2，Tmax，Cmax，AUC，Ka和t1/2（a）等药动学参数。

3　结果

3.1家兔耳缘静脉取血改为颈总动脉插管术取血

耳缘静脉取血是家兔取血常用的方法，但由于学生在实验过程中极易使静脉血管破裂，加上伤口出血凝固快及造成静脉栓塞的可能。本次实验发现，兔子耳缘静脉取血1～2次可行，多次取血无法顺利现实，即使是剪掉兔子的部分耳朵。本实验亦尝试首先给家兔注射高剂量的肝素钠溶液后，再行取血，但结果仍不太理想。

家兔颈总动脉插管术是实验动物学及相关基础研究的基本操作和技能，我校药学专业学生在生理学实验和药理学实验两门先行课程中均对该技术进行了系统的学习和训练，大部分学生都能独立完成家兔颈总动脉插管术。鉴于此，本实验对原方法中的耳缘静脉取血改为颈总动脉插管取血，结果表明，采用三通管接细导管插入家兔颈动脉后，取血简便易行、灵活方便多次操作，节时省力，实验效果比耳缘静脉取血好。

3.2血药浓度测定方法的改进

因紫外分光光度计操作简便、仪器便宜、保养经济等因素，被广泛用于学生实验中。但该法存在选择性（专属性）不强、灵敏度不高等缺陷而可能导致测定结果不准确。特别是对血液样品而言，众多的有机小分子、蛋白等多可能对测定结果有较大的干扰。该实验原有采用氢氧化钡＋硫酸锌、氯化汞等除蛋白的方法，利用重金属方法除蛋白效果不太理想，且污染环境，样品有时出现乳光，测定结果波动幅度大、误差大。文献报道[6]，利用1.5倍的乙腈消除血清中的蛋白，操作简便，效果较好。但本实验采用该方法去除蛋白测定结果还是显示重现性差，实验中我们发现不同个体家兔血清及出现的溶血的血清等都对测定结果影响较大。

该实验利用分光光度计测定家兔血清中对乙酰氨基酚浓度方法灵敏度较低、影响因素多、经常出现测定结果波动幅度大误差大的现象。因此，我们认为在保证除尽血清中蛋白等大分子物质的基础上，关键是提高测定方法的灵敏度。差示分光光度法改用浓度比样品稍低或稍高的标准溶液代替空白试剂来调节仪器的透光率以提高分光光度法精密度、准确度和灵敏度。一般分光光度法其浓度测量的相对误差在1%～3%，如采用示差分光度法测量，则误差往往可减少到千分之几。参考相关文献[7-9]，本实验以上述标准曲线中的一个样品（13 μg/ml）为研究对象，分别以0.01 M氢氧化钠溶液和水为基质配制得到的对乙酰氨基酚溶液，以水配乙酰氨基酚溶液作参比，在200～350 nm波长范围内处扫描，得到△A曲线。结果显示在0.01 M氢氧化钠溶液中对乙酰氨基酚的△A曲线显示在265 nm 的波长处有最大吸收差值，见图1。 因此选用0.01 M氢氧化钠溶液和水作配制（或稀释）乙酰氨基酚（血清）样品的介质。

3.3差示分光光度法测定方法学验证

按照上述方法，标准曲线样品在265 nm测定△A值对浓度数据进行回归，得回归方程：△A=0.027 c-0.004 5 R2=0.988 9，表明对乙酰氨基酚在1.3～13 μg范围内与△A呈良好的线性关系。本次研究结果显示，血清样品按上述方法预处理后，同一份样品在6 h内重复测定5次，△A相对标准偏差（RSD）小于5%，表明样品在实验过程中稳定，预处理方法简便可行。考虑到乙腈的潜在毒性及成本，本实验在样品前处理沉淀蛋白的过程中，采用乙醇替换文献[6]中的乙腈；另外改用差示分光光度法测定血清中的对乙酰氨基酚，该法可以在很大程度上消除干扰组分和背景吸收，提高分析方法的灵敏度。

3.4药动曲线结果

用改进后的实验方法进行实验，绘制的药时曲线，见图2。结果显示，对乙酰氨基酚在在家兔体内的口服给药基本符合一室动力学模型，最大吸收时间tmax介于50～90 min，90 min后对乙酰氨基酚基本处在清除期，240 min血药浓度下降到最大浓度的1/10以下，因此该实验可在240 min内完成采血9～11次（吸收相，最大吸收点，清除相分别3～4个时间点），获得药物的药动学参数。

图1　对乙酰氨基酚差示光谱图

图2　血药浓度-时间曲线

4　 讨论

血药浓度法估算口服对乙酰氨基酚药动学参数是药学专业生物药剂学与药物动力学课程主要的实验内容之一，对于学生理解药物的药动参数具有重要指导意义。其中，动物在给药后顺利取血及血药浓度的准确测定是该实验成功的关键。本文在参考相关文献的基础上，综合考虑学生实验技术水平，仪器材料价廉易得、安全，实验时间适中等多方面因素。对家兔取血方法，样品前处理及分析测试方法等进行了改进，实践证明，相对于以前的实验方法，改进后的实验操作简便、取血顺利；差示紫外分光光度法极大的提高了分析的灵敏度，降低了干扰因素。

总之，改进后的实验方法操作行强，测定结果准确，稳定性与重现性均好，总体实验时间适中，更适合学生教学实验。

参考文献

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Improvement of the Laboratory Teaching Course: Estimation of Orally Pharmacokinetic Parameters of Paracetamol in Rabbits

XIE Baogang1LIU Aihong2ZHAO Tiansheng3LAI Xiaoping31 Pharmacy College of Nanchang University, Nanchang 330006, China. 2 Forecasting and Analysis Center of Nanchang University, Nanchang 330006, China. 3 Deaprtment of Experiment Teaching Administration, Nanchang University, Nanchang 330006, China

[Abstract]Estimation of orally pharmacokinetic parameters of paracetamol by blood method in rabbits is one of the major experiments in the laboratory teaching course on bio-pharmaceutics and pharmacokinetics in pharmaceutical specialty. In this study, the method of obtaining plasma samples, sample preparation, and the assay for determining paracetamol in blood were optimized and improved. Our results showed that the improved method is simple and reliable for obtaining blood samples and pre-treatment, the differential ultraviolet spectrophotometric assay could significantly enhance the sensitivity of measuring analyte in blood. The improved experiment method was demonstrated to be good stability and reproducibility, which is suitable for student experiment in laboratory teaching course.

[Key words]Teaching improvement, Blood drug concentration method, Pharmacokinetic experiment, Differential ultraviolet spectrophotometric assay

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.02.020

【文章编号】1674-9308（2016）02-0031-03