腐植酸对石油污染土壤特性和生物修复效果的影响

张秀霞，韩雨彤，张　涵，丁　峥

(中国石油大学 化学工程学院 环境与安全工程系, 山东 青岛 266580)



腐植酸对石油污染土壤特性和生物修复效果的影响

张秀霞，韩雨彤，张涵，丁峥

(中国石油大学 化学工程学院 环境与安全工程系, 山东 青岛 266580)

摘要：为研究腐植酸对石油污染土壤生物修复的影响，考察了不同腐植酸含量对石油污染土壤特性以及在低含水条件下对石油污染土壤土著微生物修复效果的影响，探究了腐植酸在干旱少降水地区修复石油污染土壤的可行性。结果表明，土壤腐植酸质量分数为100 mg/g时有利于调节土壤的C/N质量比，有利于土著微生物对速效磷的利用，土著微生物酶活性比对照土壤样品有显著提高；在低含水率条件下，腐植酸质量分数为100 mg/g土壤样品的30 d石油烃降解率达到27.7%，而对照土壤样品只有5.9%。

关键词：石油污染土壤；腐植酸含量；降解率；含水率；土著微生物；酶活性

石油污染土壤危害极大[1-3]，其治理势在必行。目前，治理石油污染的方法主要有物理法、化学法以及生物法，其中生物法的研究较为广泛[4-5]。微生物可将石油烃作为生长所需的碳源和能源进行代谢活动[6]，但其需要适合的pH值、水分和养分等条件[7]。然而，很多石油污染土壤并不具备这些条件，尤其是新疆、西北等干旱缺水地区，缺少微生物生长最需要的水分。因此，有必要针对这类地区石油污染土壤的生物修复给予一些改进措施。

腐植酸，又称胡敏酸，按其形成的理化途径可分为矿物腐植酸和生化腐植酸。其中，后者系由农业废物通过微生物发酵工艺而制得，含有丰富的黄腐酸，还有氨基酸和多种微生物群，施入土壤后可以改善土壤团粒结构，增强土壤吸水量和透气性，且不会造成次生污染，堪称现代农业的绿色精灵[8]。与其他化学土壤改良剂相比，腐植酸具有很高的反应活性，能够与环境中的多种有毒活性污染物发生作用[9]，从而起到减缓环境污染的作用。此外，研究表明[10]，腐植酸可强化微生物对有机污染物的降解性能，更有效地发挥高效降解菌的降解能力。因此，笔者选用腐植酸作为土壤改良剂，应用于土壤生物修复中。

笔者向石油污染土壤中加入不同质量生化腐植酸，以调节土壤腐植酸浓度，考察腐植酸含量对石油污染土壤含水率、C/N质量比、速效磷含量、脱氢酶活性、多酚氧化酶活性和过氧化氢酶活性的影响；研究腐植酸含量在低含水条件下对石油污染土壤修复效果的影响，为降水量少、长久干旱地区的石油污染土壤的治理提供理论依据。

1实验部分

1.1　实验土壤

实验土壤采自新疆油田某钻井作业区附近石油污染土壤。该土壤质地为砂质黏壤土，外观呈浅黑色，有油味，较干燥，理化性质列于表1。采后土壤于通风处风干、破碎、过筛，取60~80目者进行实验，使用前低温冷冻保存。

表1　石油污染土壤理化性质

1.2　仪器和材料

上海秣马恒温设备厂HSX-250型恒温恒湿培养箱；上海合利仪器有限公司UV-6000PC型紫外分光光度计；昆山市超声仪器有限公司KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗仪；无锡市瑞江分析仪器有限公司RJ-TDL-5A型低速台式大容量离心机；上海洪纪仪器设备有限公司ATN-300型全自动定氮仪；上海洪纪仪器设备公司KDN-08C 型消化炉。

生化腐植酸，AR，天津市光复精细化工研究所产品，其组成为w(C)=46.6%、w(N)=3.9%、w(H)=4.9%、w(O)=26.3%、w(Ash)=10%、w(Moisture)<8%、w(Fe)≤0.3%。

1.3　实验方法

在10个培养皿中分别加入100 g 60~80目实验土壤(每2个为一组平行样品)。然后加入不同含量腐植酸使土壤腐植酸质量分数分别为0、10、50、100、150 mg/g，不加腐植酸的为对照组土壤样品。在温度28℃、空气湿度50%的恒温恒湿培养箱中培养30 d。利用土著微生物进行生物修复，每隔6 d取样，分别测定土壤含水率，石油烃、有机碳、全氮、速效磷含量以及多酚氧化酶、脱氢酶和过氧化氢酶含量。每个平行样品取3个样品进行各项指标测定，取均值为测定结果。

1.4　测定和计算方法

1.4.1测定方法

采用烘干称重法测定土壤含水率[11]；采用超声提取-紫外分光光度法测定土壤石油烃含量[12]；采用重铬酸钾容量法-稀释热法测定土壤有机碳含量；采用半微量凯式法测定土壤全氮含量；采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定土壤速效磷含量[13]；采用邻苯三酚(焦性没食子素)比色法测定多酚氧化酶含量；采用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物(TTC)还原法测定脱氢酶含量；采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶含量[14]。

1.4.2计算方法

焚烧处理因减容效果良好、消毒彻底、有利于实现城市垃圾资源化，而成为全世界垃圾处理的最主要模式。我国的城市垃圾焚烧处理率也在逐年升高，预计到2020年，我国垃圾焚烧处理率将达到50%。但生活垃圾焚烧后会产生大量的固体残渣，主要包括底灰和飞灰。飞灰是指在烟气净化系统和热回收系统中收集得到的残留物，占焚烧灰渣总量的10%～20%左右。通过焚烧，生活垃圾中33%的Pb、92%的Cd以及45%的Sb都迁移到了飞灰之中，因此垃圾焚烧飞灰中富集了大量的重金属。

从土壤的有机碳、全氮含量按式(1)计算得出土壤C/N质量比(m(C)/m(N))。

(1)

式(1)中，w(Organic matter)为土壤有机碳质量分数，mg/kg；w(Total nitrogen) 为土壤总氮质量分数，mg/kg。

从降解前后的石油烃含量按式(2)计算得出石油烃降解率。

(2)

式(2)中，η为石油烃降解率；w0、w1分别为修复nd前后土壤的石油烃质量分数，mg/kg。

2结果与讨论

2.1　腐植酸对土壤含水率的影响

图1为腐植酸质量分数对土壤含水率的影响。由图1可以看出，在空气湿度50%下，土壤样品持水性随其腐植酸含量的增大而增大。这是由于腐植酸结构中有许多大小不一的孔洞、孔隙，可以改善土壤团粒结构，增强土壤吸水量和透气性，起到一定的蓄水作用[8]。由于微生物的生命活性在一定程度上依赖于生存环境中的水分，土壤中加入适量腐植酸，可增强土壤蓄水性，在有限空气湿度下吸收空气中少量水分，并贮存于土壤孔隙中，可为微生物的生长提供必要的水分，进而提高生物修复效果。

图1　腐植酸质量分数对土壤含水率(w(Moisture))的影响

2.2　腐植酸对石油污染土壤修复效果的影响

图2为腐植酸质量分数对土壤石油烃降解率的影响。由图2可以看出，各土壤样品石油烃降解率曲线整体趋势相似。第0~12 d的降解率较小，说明降解原油微生物在实验中第0~12 d处于对新碳源的适应阶段；第12~24 d时微生物以原油为碳源，处于生长的对数阶段，降解率迅速上升；第24~30 d的降解率仍然呈上升状态，但变化减缓，这是因为碳源不足，土壤微生物生长速率减缓之故。对照土壤样品的30 d石油烃降解率为5.9%，而土壤腐植酸质量分数为100 mg/g时，石油烃降解率最佳，达到27.7%，说明适宜含量腐植酸的加入，有利于可降解石油烃的土著微生物作用，但修复效果并不是随腐植酸含量升高而无限提高。腐植酸施入量与土壤质量存在最佳比例，若超出此最佳值，多施入的腐植酸可能会造成土壤中营养比例的失衡，反而不利于土著微生物的生长。因此，土壤腐植酸质量分数为100 mg/g时，修复效果最佳。

图2　腐植酸质量分数对土壤石油烃降解率(η)的影响

2.3　腐植酸对土壤m(C)/m(N)的影响

图3为腐植酸质量分数对土壤m(C)/m(N)的影响。由图3可以看出，未加入腐植酸的对照土壤样品在20 d后m(C)/m(N)显著增高。这是由于土壤中的石油烃会影响土壤有机质的组成和结构，使土壤m(C)/m(N)发生变化，进而对土壤中微生物群落和区系产生不利影响[15]，且石油污染物破坏了氮循环相关菌落结构，而氮循环相关功能微生物在土壤发挥其生态功能中起着重要的作用[16-17]。腐植酸可为土壤提供一定量碳源，又可促进氮的吸收[18]，因此可起到调节土壤m(C)/m(N)的作用。土壤腐植酸质量分数为100 mg/g时，其m(C)/m(N)基本维持在6.5左右，最有利于降解石油烃的土著微生物利用[19]。

图3　腐植酸质量分数对土壤m(C)/m(N)的影响

2.4　腐植酸对土壤速效磷含量的影响

图4为腐植酸质量分数对土壤速效磷质量分数的影响。由图4可以看出，土壤速效磷含量在第0~12 d呈增长趋势，且土壤腐植酸质量分数为100 mg/g时速效磷含量增长量最大。这是由于腐植酸可减少土壤对可溶性磷的固定，通常土壤中Ca3(PO4)2很难溶于水，而加入腐植酸发生反应后所形成的磷酸氢盐和磷酸二氢盐都溶于水[20]，易被土著微生物吸收利用。在第12 d后，由于降解石油烃的土著微生物处于增长期，需要利用速效磷作为营养物质，速效磷含量开始呈现减少趋势，第12~24 d下降趋势明显，第24~3 0 d仍然呈减少状态，但变化减缓。这与石油烃降解率变化趋势相符，说明适宜含量腐植酸的加入可促进降解石油烃的土著微生物生长繁殖。

图4　腐植酸质量分数对土壤速效磷质量分数的影响

2.5　腐植酸对土壤多酚氧化酶活性的影响

图5为腐植酸质量分数对土壤多酚氧化酶活性的影响。由图5可以看出，各土壤样品的多酚氧化酶活性(以多酚氧化酶含量表示，脱氢酶、过氧化氢酶亦类同)均有增加，尤以腐植酸质量分数为100、50 mg/g的土壤样品增幅最大。在石油污染土壤修复过程中不断产生酚类物质促进微生物形成多酚氧化酶，后者可以将土壤中的芳香族化合物氧化成醌，进而与土壤中的蛋白质、氨基酸等物质反应生成相对分子质量大小不同的有机质和色素，完成土壤芳香族化合物的循环[21]。由于实验所选用土壤结构较差，修复初期各土壤样品中多酚氧化酶较少，加入不同质量腐植酸，多酚氧化酶含量均呈增长趋势，以腐植酸质量分数100、50 mg/g效果最佳。这说明适宜含量腐植酸的加入有助于石油污染土壤中多酚氧化酶的生成，进而有利于石油污染土壤中土著微生物进行生物修复。

图5　腐植酸质量分数对土壤多酚氧化酶活性的影响

2.6　腐植酸对土壤脱氢酶活性的影响

微生物对石油烃的降解或转化从脱氢开始，在氢的中间转化中起传递作用。脱氢酶能够促进脱氢反应，可起到氢的中间传递体的作用[22]，因此脱氢酶活性可以作为评价微生物降解石油烃能力的一种指标。图6为腐植酸质量分数对土壤脱氢酶活性的影响。由图6可以看出，各土壤样品的脱氢酶活性在第0~12 d增长较缓慢，在第12~18 d内有显著增长，且腐植酸质量分数为100 mg/g时土壤样品的脱氢酶活性增长最大，在第18 d后，脱氢酶活性降低，脱氢酶活性与石油烃降解率变化趋势基本相同。结合图2可以得出，在石油污染土壤修复初期，由于土著微生物不适应刚加入外来营养物质的新环境，不能分泌大量的土壤酶，导致脱氢酶活性变化不明显；在修复第12~18 d，脱氢酶活性增加迅速，说明土壤微生物新陈代谢增强，脱氢酶大量分泌；第18 d后各种土壤样品的脱氢酶活性呈下降趋势，是由于土著微生物在降解石油烃过程中产生的难降解物质积累，有毒代谢产物增加，从而抑制了脱氢酶的产生所致。土壤腐植酸质量分数为100 mg/g时，脱氢酶含量可增至最大值，这可能是由于适宜含量腐植酸的加入，其富含的多种含氧功能团和氨基酸功能团与难降解物质发生反应，进而减少了土著微生物修复时产生的难降解物质的毒害作用。

图6　腐植酸质量分数对土壤脱氢酶活性的影响

2.7　腐植酸对土壤过氧化氢酶活性的影响

图7为腐植酸质量分数对土壤过氧化氢酶活性的影响。由图7可以看出，在修复过程中，过氧化氢酶活性均大致呈增长趋势。过氧化氢酶能促进H2O2分解生成O2和H2O，防止H2O2在土壤中的积累对生物体产生毒害作用，并且还与土壤呼吸作用和微生物活动息息相关[21]。过氧化氢酶生长变化情况，可侧面反映石油污染土壤在修复过程中有毒物质积累情况。在土著微生物修复的第6~24 d，相对其他土壤样品来说，腐植酸质量分数为100 mg/g土壤样品的过氧化氢酶活性最大，为0.92 mg/(g·h)，也就是说其有毒物质积累较少，可促进微生物的呼吸作用，增加微生物对土壤H2O2的分解，促进过氧化氢酶的分泌。

图7　腐植酸质量分数对土壤过氧化氢酶活性的影响

3结论

(1) 在含水率较低的石油污染土壤中，腐植酸质量分数为100 mg/g时，有利于调节石油污染土壤的C/N质量比，且有助于土壤中速效磷含量的增加，可促进降解石油烃微生物的生长繁殖。

(2) 石油污染土壤腐植酸质量分数为100 mg/g时，有助于其中多酚氧化酶的生成，进而促进土壤完成芳香族化合物的循环。在土壤修复初期，可促进脱氢酶的产生，有助于脱氢反应的进行。在修复过程中过氧化氢酶活性增长量最大，可促进微生物的呼吸作用，增加微生物对土壤H2O2的分解，促进过氧化氢酶的分泌，减少修复过程中有毒物质的积累。

(3) 土样腐植酸质量分数为100 mg/g时，30 d石油烃降解率最高，可达到27.7%，而对照土壤样品只有5.9%。说明适宜含量腐植酸的加入，有助于低含水率条件下石油污染土壤修复的进行，可为干旱少降水地区此类土壤的修复提供一条可行的途径。

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Influence of Humic Acid on the Soil Characteristics and Bio-Remediation of Oil-Contaminated Soil

ZHANG Xiuxia, HAN Yutong, ZHANG Han, DING Zheng

(DepartmentofEnvironmentalandSafetyEngineering,CollegeofChemicalEngineering,ChinaUniversityof

Petroleum,Qingdao266580,China)

Abstract：In order to study the influence of humic acid in the process of oil-contaminated soil bio-remediation, the effects of humic acid with different concentrations on the characteristics and bioremediation of oil-contaminated soil under low water content condition were investigated, and the feasibility of humic acid in the oil-contaminated soil bioremediation in the arid regions was explored. The experimental results showed that the addition of humic acid with mass fraction of 100 mg/g could help to balance the mass ratio of carbon to nitrogen (m(C)/m(N)) in oil-contaminated soil, and was in favor of the indigenous microbial utilization of available phosphorus, so the indigenous microorganism enzymatic activity increased significantly than that in the control soil samples. Under the conditions of low moisture content, the hydrocarbon degradation rate of the oil-contaminated soil sample adding humic acid of mass fraction 100 mg/g was 27.7% in 30 d, while that of the control soil samples was 5.9%.

Key words：oil-contaminated soil; humic acid content; degradation rate; water content; indigenous microorganism; enzyme activity

中图分类号：TE991.3

文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1001-8719.2016.01.022

文章编号：1001-8719(2016)01-0164-06

基金项目：山东省自然科学基金(ZR2014BM023)、中国石油科技创新基金(2009D-5006-07-01)、青岛市科技发展指导计划项目(KJZD-12-65-jch)、中央直属高校科研专项基金(11CX05011A)、中国石油大学(华东)研究生创新工程(CX-1219及CX2013035)、研究生金点子项目(JDZ1405030)和创新基金实验项目(14CX06101A)资助

收稿日期：2014-07-28

通讯联系人： 张秀霞，女，教授，博士，从事石油污染土壤修复研究；E-mail：zhxiuxia@upc.edu.cn