MicroRNA对动脉粥样硬化相关因素的调节作用*

陈和明综述　周新民审校



MicroRNA对动脉粥样硬化相关因素的调节作用*

陈和明综述周新民#审校

微小RNA(MicroRNA，miRNA)作为重要的调节分子，主要通过对血管平滑肌细胞、血管内皮细胞和单核巨噬细胞进行调控而参与动脉粥样硬化(AtheroSclerosis,AS)的发生发展。筛选AS早期异常表达的miRNA，并深入研究这些miRNA对AS相关致病因素的调节网络，对进一步研究AS发生的分子机制和寻找预防与治疗靶点具有重要意义。

微小RNA；动脉粥样硬化；分子靶标

动脉粥样硬化(AS)是动脉硬化的重要类型之一，其主要特征为在大、中型动脉中膜内层和内膜中含有粥样物质(由脂质沉积、坏死而形成)，并伴有纤维组织和平滑肌细胞(Smooth Muscle Cell,SMC)增生。冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)和脑卒中是AS的常见并发症，也是世界两大主要死亡病因。微小RNA(miRNA)是一类在进化上高度保守的短链非编码RNA，广泛存在于各类型细胞中，通过与靶基因信使 RNA不完全互补结合、降解或抑制翻译，从而调节特定靶基因在细胞内的表达。最近研究发现miRNA参与了AS的发生发展，可能成为AS诊断及预后判断的生物标志物[1]。本文综述部分有代表性的miRNA对参与AS形成过程中三种主要细胞的调节作用，为AS的诊断、预后判断和靶向基因治疗提供新思路。

1　miRNA对血管内皮细胞的调节作用

正常动脉内皮细胞的光滑表面不仅具有屏障功能，还具有抗凝血、调节血管张力、调节细胞生长及表达炎性介质和黏附分子等功能。AS斑块形成首先由慢性炎性内皮细胞损伤，表现为内皮细胞表达E-选择素(E-selectin)、细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)上调，促进单核细胞边流、黏附和活化，内皮细胞释放单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein 1,MCP-1)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)增加，促进血液单核细胞附着内皮细胞并向内皮下转移，进而形成荷脂巨噬细胞甚至粥样病变。多种miRNA 可对血管内皮细胞的这种慢性炎症反应进行调控和修复损伤内皮，从而阻遏AS的发生发展。血管内皮细胞的修复取决于成熟内皮细胞的增殖、迁移能力和循环内皮祖细胞归巢至受损裸露内皮部位，以及再内皮化能力。而miR-126、miR-21不仅能抗炎还重在影响内皮细胞的增殖和迁移能力，调控血管内皮细胞的修复[2，3]。此外，血液流变学改变也可造成血管内皮细胞损伤，进而引发AS。湍流所产生的低剪切力常发生在血管分叉处，低层流剪切力可诱导miR-21、miR-92a、 miR-663表达，导致病理性内皮细胞表型，使这些地方好发AS，而高层流剪切力可诱导内皮细胞表达数种miRNA，并具有抗炎、抗AS作用，如miR-10a、 miR-19a、miR-23b、 miR-101、 miR-143/145等[4]。

1.1miR-126

miR-126 被认为是血管内皮细胞特异性的miRNA，其编码基因位于人类第9 号染色体表皮生长因子样结构域7(Epidermal Growth Factor Like Domain 7，EGFL7) 基因的第7 内含子中，与EGFL7 基因共表达。miR-126可在转录水平调控VCAM-1的表达，miR-126上调可抑制VCAM-1的表达，减少白细胞对内皮细胞的黏附，抑制AS的形成[5]。Pan等[6]在载脂蛋白E(ApoE)敲除小鼠实验中发现AS组小鼠miR-126表达下调，VCAM-1表达上调，而用阿托伐他汀治疗后miR-126表达上调，VCAM-1表达降低，粥样病变减轻。表明阿托伐他汀可通过调节miR-126及其靶基因VCAM-1表达发挥抗炎效果；但在冠心病和胰岛素抵抗的糖尿病病人外周血中miR-126表达却是降低的，这可能由内皮微泡包装缺陷造成。miR-126 还对血管生成起重要作用，有研究证实，在血管发育过程中，miR-126缺乏可上调其作用靶点SPRED-1 和PIK3R，二者为血管内皮生长因子(VEGF)的负性调控因子，能使VEGF减少，导致血管内皮细胞增殖迁移不良，严重影响血管内皮维持完整性、损伤修复及血管再生。miR-126下调SPRED-1 和PIK3R则可增加VEGF表达促进内皮细胞修复和血管再生，从而防范AS。

1.2miR-10a

miR-10家族由miR-10a 和miR-10b 组成，进化上高度保守，其编码基因定位于HOX基因簇。血液高层流可诱导内皮细胞产生miR-10a，抑制内皮细胞的炎症反应。对成年猪AS易感位点的miRNA分析发现miR-10a的表达降低；敲除miR-10a的人动脉内皮细胞miRNA芯片分析显示主要炎症信号通路核转录因子κB(Nuclear Factor κB，NF-κB)上调[7]。研究表明，丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases，MAPKs)与β-转导重复相容蛋白(β-Transducin Repeat-Containing Protein，β-TrCP)作为NF-κB抑制蛋白α(NF-kappa-B Inhibitor alpha，IKbα)降解的调节子是miR-10a的靶基因[8]。由于miR-10a抑制IKbα降解，阻断NF-κB活化，故有抗炎和抗AS作用。但其具体机制不详。

1.3miR-21

miR-21是第一个发现的哺乳动物 miRNA,成熟miR-21高度保守，其编码基因位于17号染色体短臂23区2带TMEM49基因内含子区，自身具有启动子，可独立转录。miR-21的靶基因为多种抑癌基因[9]。血流剪切力改变可影响miR-21表达[10]，在震荡剪切应力作用下，原癌基因c-Jun 与miR-21 基因启动子结合，可使miR-21 表达增加，抑制其靶基因过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome Proliferators-Activated Receptors-α，PPAR-α)(血管壁中的一种重要抗炎介质)的表达。震荡剪切应力和过表达miR-21可增加VCAM-1及MCP的表达，导致单核细胞与血管内皮细胞黏附，从而促进炎症反应的发生[11]。Zhuo等[12]发现AS患者内皮祖细胞中miR-21表达增高，内皮祖细胞增殖能力降低，可能机制为miR-21通过抑制其靶基因WW结构域蛋白1(WW Domain-containing Protein 1，WWP1)而活化转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)信号通路，进而抑制内皮祖细胞增殖。

2　miRNA 对单核/巨噬细胞的调节作用

AS斑块中存在大量泡沫细胞，其主要来源为单核/巨噬细胞，研究发现，miRNA 可通过对单核巨噬细胞的功能调节，参与AS的发生发展[13]，如miR-33通过调节巨噬细胞内胆固醇的代谢，促进泡沫细胞形成；而miR-155通过调节巨噬细胞促炎和抗炎因子的产生，在不同阶段分别起促AS或抗AS作用。

2.1miR-33

miR-33家族包括miR-33a和miR-33b ，分别位于2个编码基因sreb2与serb1的内含子中。miR-33a/b在种子序列外有2个核苷酸不相同，但还是被认为可作用于相同的靶基因。研究发现人类颈动脉粥样斑块内miR-33a/b表达显著增高，可能机制为miR-33 通过靶向作用于胆固醇转运体ABCA1和NPC1，抑制胆固醇外流，促进泡沫细胞形成[14]。在AS小鼠模型中抑制miR-33表达可促进巨噬细胞中胆固醇外流，载脂减少，粥样斑块减轻[15]。此外，miR-33还参与调控巨噬细胞内与能量平衡有关的基因，巨噬细胞线粒体miR-33的靶基因有过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)和丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)，这两个基因通过促进线粒体生物合成、呼吸链与ATP合成，从而介导胆固醇流出；转染了miR-33抑制剂的巨噬细胞，PGC-1α表达增高，细胞呼吸加强，线粒体生物合成与ATP生成增多，促进胆固醇流出，表明miR-33具有促AS作用[16]。给予1型糖尿病小鼠抗miR-33治疗，可以减少斑块内巨噬细胞含量及炎性基因表达，使AS消退，表明miR-33有促AS作用[17]。

2.2miR-155

miR-155是AS中研究最深入的miRNA，在调节巨噬细胞慢性炎症反应、心血管疾病的发生发展过程中具有重要作用[18]。氧化型低密度脂蛋白(OxLDL)、γ-干扰素(IFN-γ)、Toll样受体(TLR)活

化等可诱导miR-155表达；miR-155可抑制细胞因子信号传导抑制因子(Suppressor Of Cytokine Signaling 1，SOCS-1)和Bcl-6，促进促炎趋化因子-2(CCL2)、白细胞介素-5(IL-5)、一氧化氮合酶-2(NOS2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达，介导巨噬细胞的炎症反应。细胞人和鼠的主动脉粥样斑块miR-155呈高表达，并被视为潜在的治疗靶点[19]。但最近Li等[20]发现miR-155通过靶向抑制CARHSP1(具有稳定TNF-α mRNA作用)而抑制泡沫细胞形成，起到抗炎、抗AS作用。还有研究[21]显示，移植敲除miR-155的骨髓细胞至LDL敲除小鼠和ApoE敲除小鼠，并喂高脂饲料，可出现两种不同结果，前者可使炎症扩大，AS病损加重，斑块稳定性降低，提示miR-155具有抗AS作用；后者却使斑块中巨噬细胞减少，粥样斑块减小，即miR-155有促AS作用。miR-155这种功能的不同，有研究者认为很大程度上是由于AS病变发展阶段不同所致，因为关键靶基因的表达具有明显的阶段特异性[22]。

3　miRNA 对血管平滑肌细胞(VSMC)的调节作用

内皮细胞和巨噬细胞释放的趋化因子促使VSMC向内膜迁移、增殖，成为AS斑块的主要细胞，并促进病变持续发展。VSMC表面有LDL受体，可结合、摄取LDL及VLDL而成为泡沫细胞，进入中膜的SMC发生表型转变，即由收缩型转变为合成型，AS斑块中VSMC呈合成型，其分泌的大量胶原纤维、弹力纤维、蛋白多糖，构成斑块间质，并合成、释放多种生长调节因子，如血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和平滑肌细胞源性趋化因子，促进更多的中膜VSMC向病灶迁移和增殖。miRNA在促使VSMC表型转化、迁移及增殖中起着重要的调节作用，如miR-143/145可促使VSMC表型转化，而miR-21、miR-221/222、miR-146a可刺激VSMC增殖[23]。

3.1miR-143/145

研究发现某些miRNA可通过抑制VSMC增生而改变VSMC表型，在这些miRNA中，miR-143/145被认为是VSMC收缩表型的主要调节者。miR-145不仅刺激成人VSMC分化，而且促进多能神经嵴干细胞分化为VSMC[24]。在正常血管壁miR-143/145簇表达丰富，而在血管成形术损伤的颈动脉和不同肿瘤细胞系中表达却下调[25，26]。进一步研究证实，miR-145通过靶向Kruppel样因子5(Krupple-like factor-5，KLF-5)基因起调节作用，过表达KLF-5使VSMC分化标志基因平滑肌细胞抗体 (SM α-actin)表达减少，而转染miR-145寡核苷酸模拟物能上调SM α-actin表达，提示miR-145通过靶向KLF-5基因促进VSMC分化[27]。高胆固醇饮食喂养的ApoE敲除小鼠血管组织中，miR-143/145表达降低，给予ApoE敲除小鼠含miR-143/145的囊泡可减轻AS病变[28]。提示miR-143/145通过促进VSMC向收缩表型分化来减轻AS病变。

3.2miR-21、miR-221/222和miR-146a

miR-21可通过不同机制调节VSMC增生和向收缩表型分化，也是第一个被证实通过沉默磷酸酶和肿瘤抑制蛋白PTEN，并增加B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)表达来调节VSMC生长和存活的miRNA；转化生长因子β(TGF-β)和骨形态蛋白(BMPs)可促进miR-21表达增高，通过抑制凋亡蛋白4(一种肿瘤抑制蛋白)而上调VSMC限制性收缩蛋白，从而促进VSMC分化[29]。miR-221/222通过抑制其靶基因p27kip1和p57kip2(两者都是细胞周期进程的负调节子)刺激VSMC增生[30]。miR-146a在培养的大鼠VSMC和血管新生肥厚内膜中，可直接通过靶向Kruppel样因子4(KLF4)促进VSMC增生,KLF4与miR-146a之间存在反馈机制，miR-146a抑制KLF4表达，而KFL4在转录水平抑制miR-146a表达。另一KLF成员KLF-5可促进miR-146a转录。三者形成调节网络共同调控VSMC增殖[31]。在AS斑块中抑制VSMC增生，促进其向收缩表型分化可起到抗AS作用。

4　miRNA与AS的基因治疗

采用外源性给予miRNA模拟物或拮抗剂来增加或降低miRNA的表达水平是目前miRNA基因治疗的主要方法。但miRNA的某些功能特性限制了其在临床上的应用，miRNA对靶基因的调节存在一对多和多对一的关系，即一个miRNA可以同时调节多个靶基因，而一个靶基因同时也可受多个miRNA调节。所以miRNA的抑制效应是非特异的，若给予外源性miRNA，很可能造成脱靶效应或靶向多个蛋白，引起副反应。为避免静脉给予外源性miRNA模拟物或抗miRNA的非靶点不良反应，Wang等[32]采用局部运用Anti-miRNA释放技术，将含有Anti-miR-21的冠脉支架先植入人乳内动脉中，再移植到实验裸鼠的主动脉，28天后取出检查，发现其明显抑制了肌性内膜增生，同时又不影响支架的再内皮化，且不干扰其它脏器功能，避免了目前药物涂层支架的副作用，为基因治疗冠脉支架植入后再狭窄提供了新途径。Wei等[33]采用将 miR-342-5p掺入普朗克凝胶中涂抹于病变血管外膜，也达到了局部治疗效果，且未影响其它组织器官功能，副作用也少。

5　展望

miRNA对基因表达具有精细的调控作用，单个miRNA对某一蛋白质表达水平的影响轻微，但当其同时调节某一信号通路的数个相关靶基因时所产生的累积效应将十分明显[34]。常用的慢病毒或腺病毒转染基因治疗方式在实际临床应用中仍存在危险，采用纳米脂质颗粒包裹人工合成的miRNA靶向投放将具有深远的应用前景[35]。与传统药物治疗不同，采用miRNA基因治疗可调控整个基因和蛋白网络，针对网络调控中的关键调控节点进行靶向治疗将是未来miRNA基因治疗的发展方向。此外，筛选AS早期miRNA高表达可作为疾病诊断的标志物，并可实现早期干预。深入研究miRNA对AS相关致病基因的调控网络，对研究AS的发生机制和寻找预防与治疗靶点具有重要意义。

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本文作者简介：

陈和明(1973-)，男，汉族，硕士，主治医师，研究方向：冠状动脉粥样硬化发生发展的分子机制和外科治疗研究

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国家自然科学基金(81470507)

单位]中南大学湘雅二医院心脏大血管外科，长沙 410011；

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本文2016-05-15收到，2016-06-10修回

R543.5[文献标识码]A

1005-1740(2016)03-0058-05