非对映异构体杂质在合成多肽药物中的相关探究

潘俊锋

(深圳翰宇药业股份有限公司,广东　深圳　518054)



非对映异构体杂质在合成多肽药物中的相关探究

潘俊锋

(深圳翰宇药业股份有限公司,广东深圳518054)

探讨非对映异构体杂质在合成多肽药物中的研究及控制。通过研究合成多肽药物氨基酸的消旋的作用机制，观察非对应异构体杂质的产生过程，从合成原料、工艺操作以及检测方法方面提供合理的质控建议。了解部分氨基酸水解后产生的水解杂质以及消旋产生的非对应异构杂质是合成多肽药物的重要物质，应加强对非对映异构体杂质的研究与控制。

非对映异构体杂质；多肽药物；消旋

多肽最初的合成方式为液相合成，但是液相合成的步骤较为复杂，每个环节需要进行单独的纯化及分离，所以在实际操作过程中受到很多限制[1]。美国生物化学家R.Bruce Merrifield于1963年发明了多肽固相合成法，提出用固相树脂作为载体合成四肽化合物[2]。在随后的四十几年里，固相合成法不断的发展，广泛应用于蛋白质与多肽的研究中[3]。固相合成法是将于固相载体连接的首个氨基酸作为起点，通过活化、耦合以及脱保护等一系列的循环过程，将保护基进行逐一连接最终形成多肽。除甘氨酸外，大部分的氨基酸为手性分子，因此，在合成过程中会出现消旋化，而消旋的产生会丢失肽分子整体或部分的化学信息，加之多肽类药物的生物活性与其立体结构有直接关系，所以加强对多肽合成过程中非对应异构体杂质的研究有重要意义[4]。本文通过对多肽药物合成过程、消旋化的机制以及非对应异构体杂质的控制展开探讨，旨在为非对应异构体杂质的研究做出参考。

1　多肽药物的简介

1.1多肽药物的组成

多肽是一种分子结构介于氨基酸与蛋白质之间的化合物，其相对分子量小于10000。多肽类药物用于治疗糖尿病、肿瘤、中枢神经系统疾病、心血管疾病、骨质疏松、肢体肥大、胃肠道疾病、免疫系统疾病以及抗菌中有显著治疗效果。目前全球范围内经批准上市的多肽药物约有80种，其中，治疗糖尿病类药物7种、抗肿瘤药物17种、治疗感染与免疫系统疾病16种、治疗血管及泌尿系统疾病9种，剩余其他药物31种。

1.2多肽药物的来源

目前市场上多肽药物的获取途径主要有3种：(1)通过基因重组多肽;(2)采用化学合成多肽;(3)从生物中进行提取。目前大部分多肽类药物均为化学合成。

2　多肽药物的设计与发现

2.1天然活性多肽

从自然存在的生命体中进行提取分离，通过活性测定方法，将具有开发价值的活性多肽筛选出来，是目前研发新药的模式。多多肽分子参与了许多机体的代谢、生理及病理过程。根据这些自然现象可以发现许多新的多肽物质。例如艾塞那肽的发现及成功上市，胰高血糖素样肽-1可以有效抑制胃排空，使肠胃蠕动减少，可以帮助人们控制食物的摄入，达到减轻体重的目的，但是由于胰岛血糖素样肽-1的半衰期时间非常短，只有几分钟，人们通过不懈的努力，将其养殖为艾塞那肽，作为治疗糖尿病的有效药物成功上市。

2.2基于分子合成的多肽药物

多肽药物的合成目前来看仍是一项耗资较大、风险较高的工程，近年来，不同的理论合成方法及分子模拟技术在多肽药物的合成中得到了较为广泛的应用。由于多肽药物合成过程的耗资较大，使用的成本原料较为昂贵，所以如何减少药物合成中杂质的出现是目前比较热门的研究。

3　肽合成中氨基酸消旋化的作用机制

消旋化的作用机制分为直接烯醇化和5(4H)-噁唑酮两种。

3.1直接烯醇化

肽缩合过程中，受碱催化的烯醇化机制有着重要作用，消旋的程度与活化羟基α位质子的酸性、碱性、温度及溶剂有关。氨基酸α位质子的酸性程度又与取代基的性质有关。

3.25(4H)-噁唑酮

5(4H)-噁唑酮是肽合成过程中的重要中间体，氨基酸活化的过程中会产生5(4H)-噁唑酮。5(4H)-噁唑酮的化学结构不稳定，是导致氨基酸消旋化的主要原因。噁唑酮对氨基酸的解速率与形成能力直接影响了肽耦合反应的消旋能力。另外，氨基组分的亲核能力对多肽的缩合反应也有很大的影响[5]。

4　非对应异构体杂质的控制及相关问题

4.1加强原料的质控

各种保护氨基酸是合成多肽药物的直接来源，因此，应加强对原料光学纯度的质控，从根源处下手。目前大多数多肽药物合成时，在初始原料保护氨基酸的内控标准中，仅将旋度作为主要标准。但是，因比旋度检查受到专属性及灵敏性的限制，使得此项指标不能作为控制氨基酸光学纯度的考核指标，对于旋度数更小的保护氨基酸更是无法满足。因此，加强对初始原料保护氨基酸光学纯度的质量控制更为重要。

4.2严格规范工艺过程

在多肽的合成过程中，肽键与消旋之间是竞争关系，因此，应对消旋的机制熟悉掌握，对氨基酸侧链保护基及缩合试剂重点关注，考察投料比与反应条件，尽可能将消化程度降至最低。另外，当目标肽中存在His、Cys以及Phe等氨基酸时，对合成工艺需要更为关注，此类氨基酸易发生消旋化，在进行此类氨基酸的缩合时，可考虑使用D-构型的氨基酸制作差向异构体的对照品。采用色谱条来检查当前工艺条件下氨基酸的消旋化程度，进一步改善缩合工艺。根据相关研究表明[6]，使用高效的缩合试剂，增加保护氨基酸的投料量，可提高肽键缩合速度，降低消旋的程度及风险。

4.3选择最佳的检测方法

与大部分合成药物的检测方法相同，多肽药物中非对映异构体杂质也可以通过HPLC进行检测，常用的系统为反相色谱，使用C4、C8、C18等。相关研究表明，使用C18柱、水、乙腈进行梯度洗脱后的色谱系统对固相法合成的七肽可进行良好的分离。但是，当肽链增长以后，小部分氨基酸消旋化产生的非对应异构体杂质通过反相色谱无法检测出，此时可综合产品的性质使用其他的色谱系统，如毛细管电泳法、离子交换色谱法等。离子交换法在低到中压环境下进行分离多肽产物的效果显著。有研究证实，将NaAc作为起始缓冲液，将含有NaAc的NaCl溶液作为终止缓冲液，可在CM-52阳离子纤维素柱的水解胶原多肽中成功分离4个组分，证明例子交换法分离多肽产物的作用。

根据相关研究表明，多肽的光学纯度可以采用HPLC-MS进行检测。首先，多肽在DCl/CD3COOD溶液中进行水解，使用N-a(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺将水解后的氨基酸再次进行衍生化，使用普通的 RP-HPLC 或 GC 即可将衍生化后的 D 和 L-构型的氨基酸良好分离，可以将多肽中消旋氨基酸的含量进行测量。在这个过程中使用氘(D)代试剂水解是非常重要的，因为在水解的过程中，氘(D)是消旋氨基酸的α位质子，通过检验可区分多肽中原有的氨基酸与水解中产生的消旋、该方法的专属性优良，适用范围较广，广泛应于肽类药物的检测中。

4.4优化存储及运输条件

多肽药物的稳定性较差，所以在常规的冻干、制剂及运输过程中会受到温度、湿度及pH的影响后发生水解或消旋。因此应综合肽类药物的特性及稳定优化实验条件及运输条件，进行稳定性测试，将得到多肽药物的最佳环境进行记录，根据环境优化冻干及制剂的条件。例如，某抗艾多肽在弱碱性环境中可保持较高的稳定性，那么冻干与制剂的过程中应尽量避免使用酸性及强碱性制剂，因为消旋化是不可逆的反应，所以即便后续步骤中可以通过试剂来调节酸碱值，但一旦在调和前发生消旋，影响药物的纯度和有效性。

5　结　语

消旋的产生会丢失肽分子整体或部分的化学信息，加之多肽类药物的生物活性与其立体结构有直接关系，所以加强对多肽合成过程中非对应异构体杂质的研究有重要意义。氨基酸消旋化产生的非对映异构体杂质是多肽药物合成过程中的重要环节，而大部分研发人员对此类杂质的研究与关注甚少，通过本次研究希望可以引起相关领域人员的重视，加强每个环节的质控，采用合适的方法对非对映异构体杂质研究检测。

[1]黄惟德,陈常庆.多肽合成[M].北京:科学出版社,1985:47.

[2]MERRIFIELD R B. Solid phase peptide synthesisⅠ. The synthesis of atetrapeptide[J].J Am Chem Soc,1963,85:2149-2154.

[3]郜炎龙,吴超柱,徐凡,等.多肽药物固相合成中的水解杂质和非对映异构体杂质的研究[J].重庆理工大学学报(自然科学版),2014,28(3):69-76.

[4]汪雪峰,董利阳,王钧,等.治疗自身免疫性疾病多肽药物的研究进展[J].中国药理学通报,2014,30(5):732-734,735.

[5]张宇,乌恩,王国成,等.肽合成[J].天津药学,2011,23(5):54-58.

[6]付晓菲,徐风华,苏欢欢,等.多肽药物酰米菲肽抗抑郁作用研究[J].第二军医大学学报,2014,35(5):539-543.

Related Exploration of Diastereomer Impurities in the Synthesis of Peptide Drugs

PANJun-feng

(Shenzhen Hybio Pharmaceutical Co., Ltd., Guangdong Shenzhen 518054, China)

The diastereomer research and control of impurities in the synthesis of peptide drugs were investigated. Through research of the mechanism of action of racemic amino acids in synthesis of peptide drugs, observing the corresponding isomer impurity production process, reasonable quality advice was put forward from the aspects of synthesis of raw materials, process operation and test method. After understanding the partial hydrolysis amino acid hydrolysis to produce impurities and despun create the corresponding heterogeneous impurities is important material for the synthesis of peptide drugs, strengthening the diastereomer impurities and control was put forward.

diastereomer impurities; polypeptide drugs; racemic

潘俊锋(1978-)，男，中级工程师，本科，从事药物合成等工作。

O62

A

1001-9677(2016)012-0053-02