晚期糖化终产物产生的皮肤自发荧光对糖尿病及其并发症诊断的重要意义

王彬彬　张翠萍　赵志力　付小兵（.北京军区总医院激光整形外科中心，北京 00700；.解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室，北京 00048）



晚期糖化终产物产生的皮肤自发荧光对糖尿病及其并发症诊断的重要意义

王彬彬1张翠萍2赵志力2付小兵2
（1.北京军区总医院激光整形外科中心，北京 100700；2.解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室，北京 100048）

晚 期糖 化终 产 物(advanced glycosylation end products, AGEs)是糖和蛋白质之间非酶反应的产物。近年来的研究表明，AGEs水平与糖尿病及其并发症有着一定的相关性。AGEs可以产生荧光，通过测量皮肤自发荧光强度可以了解AGEs的积聚量，从而判断疾病进程。由于皮肤自发荧光的测量具有无创性和稳定反映AGEs水平的特点，目前已经成为检测AGEs的重要手段。

1　AGEs的形成及其作用机制

1.1AGEs的形成AGEs是糖和蛋白质非酶反应的终产物。1912年法国科学家Millard首次发现AGEs的形成过程，后为纪念这位科学家称此反应为美拉德反应（Millard reaction）。其形成过程是糖、脂肪中的羰基和蛋白质、核酸等物质的游离氨基之间发生反应,生成“席夫碱（Schiff base）”[1]，然后通过结构不可逆转的重组,形成更稳定的Amadori产物，Amadori产物通过进一步的结构性变化（包括氧化、脱水和降解）最终形成稳定的不可逆的AGEs[2]。AGEs具有高度的反应活性。在正常生理过程中，这种反应难以完全避免，但是如果反应过度，高水平的AGEs进入组织器官当中，就会造成组织损害，破坏正常细胞的结构和功能，从而引发一系列疾病。因此，AGEs几乎被看作是毒素，在糖尿病和多种慢性病当中，都是人体的重要致病因素[3]。

1.2AGEs的作用机制AGEs对组织的损害主要通过两个途径。首先，AGEs改变了细胞外基质蛋白的性质，AGEs的形成通常需要几个月甚至几年时间，因此AGEs主要修饰长寿的分子，例如胶原等，从而形成不溶的、功能下降的复合物，且随着时间推移，形成增多[4]。糖化的胶原交联增加使得其弹性下降，这解释了AGEs与心血管疾病的关系。其次，细胞膜上的AGEs受体（AGER）可介导糖化基质的摄取、吸收和降解，例如在巨噬细胞，AGER摄取糖化基质后产生低分子质量、可溶性的“第二代AGEs”,然后“第二代AGEs”离开细胞,进入血液，进入肾脏后发生免疫反应，改变肾脏蛋白质的结构，对肾脏生理功能造成损害[5-7]。AGEs在进入肝脏后形成交联的AGE复合物 ，大部分复合物被库普弗细胞（Kupffer 细胞）和内皮细胞内吞和降解，肝脏对“第二代AGEs”的降解可以阻止糖尿病并发症、心血管病等疾病的发生。但是过量的AGE复合物与内皮细胞表面的AGER 相互作用，会改变内皮细胞的结构，使其通透性增加，进而促进凝血反应，在使抗凝物质减少的同时还会导致血栓形成风险增加[8]。因此，AGEs的形成加剧了一些慢性疾病如糖尿病、肝硬化、肾功能衰竭、心血管疾病、阿尔茨海默病等的病理过程。

2　皮肤自发荧光是AGEs 的重要检测手段

AGEs是体内产生的异源性化合物，因此，寻求合适的检测手段定量测定AGEs的积聚量具有重要意义。以往AGEs的检测方法主要是针对血浆或血清，利用分光光度技术和斯派克荧光技术，根据AGEs的荧光特征属性(在370 nm激发，在440 nm发射)对低分子质量的AGEs进行测定[9-10]，或采用酶联免疫吸附法测定AGEs的可溶性受体碎片。但是，根据可溶性AGER的水平来定量检测血清和组织中AGEs积聚量的准确性值得怀疑，并且,这种方法也没有考虑到其他配体与AGER结合对测定结果的影响。这种缺乏一致性的分析只能作为AGEs的大致分析数据而不能用于临床检测。此外，血浆或血清中AGEs的检测结果不能准确反映视网膜、肾脏、血管壁等组织中AGEs的积聚量。另外，由于体内AGEs可以通过肾脏排出体外，因此体内AGEs的积聚量也与肾功能密切相关[11]。当检测出血浆或血清内AGEs升高时很难解释是由于肾脏本身的疾病还是由于其他疾病所导致。大多数情况下通过组织检测的结果更能准确地反应体内AGEs的积聚水平，且以测量皮肤组织中AGEs积聚量为最佳[12]。虽然检测组织中AGEs的水平能更好地反映AGEs长期积聚导致的组织损伤，但是组织活检是侵入性检查，会对检查者造成额外的伤害。因此，寻求简单且容易操作的临床检测手段非常必要。皮肤自发荧光检测-糖基化检测仪（AGE-Reader）,不仅满足了无创性要求，而且在长期的临床实践中被证明是能够准确反应体内AGEs水平的重要检测手段[13]。

AGE-Reader根据AGE的荧光特性来测量AGE在皮肤组织中的积累水平。它用激发光源照射面积约4 cm2的皮肤组织，分光计测量发射光(荧光，波长420～600 nm)和反射的激发光(波长300～420 nm，峰值在370 nm的紫外光),皮肤自发荧光的计算为发射光和反射的激发光的比值乘以100,表示任意单元[14]。因为皮肤本身颜色会吸收光线从而影响自发荧光测量,因此皮肤反射在300～420 nm范围的光会与一块白色聚四氟乙烯(假设反射100%)进行对比以控制误差[15]。AGE-Reader检测皮肤自发荧光的方法是，取前臂掌侧皮肤（肘关节以下10 cm）以及小腿后侧皮肤，在无灯光照射的房间内检测以避免周围光线对检测结果的干扰，选择光滑、平整的皮肤区域，避免因受测区皮肤不平整（如突出的血管、瘢痕等）而对结果产生干扰。检测分两步进行：第一步是校准，首先测暗电流以校正电荷耦合设备光感受器的噪音，然后确定反射率，以白光反射为标准（假设100%反射）；第二步是进行皮肤自发荧光的测定，收集所有从皮肤发射的300～600 nm波长的光线，在420～600 nm波长之间的光线被看作是皮肤发射形成，分光计测量数值，以发射光和反射的激发光的比值再乘以100为皮肤自发荧光值。测定50次，取其平均值作为检测结果，以保证最佳可重复性结果。

3　皮肤自发荧光对于糖尿病监测及其并发症诊断的重要意义

糖尿病及出现糖尿病并发症时，主要通过检测皮肤自发荧光来反映AGEs的积聚量，再进一步研究AGEs与疾病的关系。AGEs是长期积累的糖化产物，而糖尿病本身就是糖代谢紊乱的慢性消耗性疾病，其并发症也是AGEs长期积累所致。因此，检测皮肤自发荧光对于糖尿病及其并发症的诊断和判断疾病进程具有重要意义。

3.1皮肤自发荧光检测与1型糖尿病（T1DM）研究表明，通过测定AGEs来监测T1DM糖尿病患者的胰岛素水平，与检测糖化血红蛋白相比具有更长回溯期并且简便无创[15]。Sugisawa等[16]的观点与上述观点一致，认为通过测定AGEs不仅可以监测长期胰岛素控制水平，而且发现AGEs的积累量与T1DM的心血管并发症的发生密切相关。Genevieve等[17]的研究表明，皮肤自发荧光与T1DM血糖长期控制情况和相关并发症（如视网膜病变、蛋白尿、肾小球滤过率下降等）有着必然的联系。而 Chabroux等[18]的研究也表明，肾病并发症和神经系统并发症与皮肤自发荧光具有一定的相关性，但视网膜病变与皮肤自发荧光不具有相关性，是否吸烟、性别和体脂肪健康指数也与皮肤自发荧光无相关性。上述两项研究中关于T1DM视网膜病变与皮肤自发荧光关系的结论并不一致，还需要进一步的验证。

3.2皮肤自发荧光检测与2型糖尿病（T2DM）荷兰研究人员的一项研究结果表明,皮肤自发荧光可作为评估T2DM患者血管受损的标志物[19]。研究者使用峰值强度为370 nm的荧光管对参试者的前臂皮肤进行测量后发现, T2DM患者的平均皮肤自发荧光强度比健康对照组高33%,且并发大血管病变和微血管病变的患者具有更高的自发荧光水平。英国前瞻性糖尿病研究结果认为,皮肤自发荧光强度对T2DM患者心血管并发症的预后有预示作用，并且可以识别潜伏期的心血管问题[20]。Noordzij等[21]研究证实T2DM患者心血管并发症与皮肤自发荧光强度具有独立相关性。Monami等[22]认为，对于T2DM患者，皮肤自发荧光强度不仅与患者高血糖的程度有关，而且还与年龄、吸烟、肥胖和代谢综合征等因素相关。

3.3T1DM和T2DM共同作用AGEs的积累对两种类型糖尿病的并发症也有共同的影响。Hang等[23]的研究表明，AGEs无论在T1DM还是在T2DM中对视网膜都有损害，影响视觉，动态监测AGEs可以检测糖尿病黄斑水肿的进展和视觉功能。Shen等[24]认为，AGEs与糖尿病足的发生具有相关性，在筛查糖尿病足风险中具有一定的意义。

4　结 论

糖尿病是糖代谢紊乱造成的慢性消耗性疾病，伴随而来的并发症以及炎症反应给糖尿病患者带来了长期痛苦。创伤的延迟愈合或者迁延不愈是糖尿病患者的主要并发症之一，有研究表明与AGEs受体有着密不可分的关系[25]。皮肤自发荧光可测量组织中AGEs的积聚量,因此可以通过自发荧光波谱或强度的变化来观察糖尿病的进程。此方法无创、易操作，只需要一个暗环境和一台计算机就可以完成，不会给患者带来任何痛苦。

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DOI:10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 01. 019

基金项目：国家973计划资助项目（2012CB518105）；国家自然科学基金项目（81121004, 81230041, 81171798）

通讯作者：赵志力,副主任医师（E-mail: zhilizhao@vip.sina.com）张翠萍，副研究员（E-mail: zcp666666@sohu.com）

收稿日期：（2015-12-18）