小汗腺自发荧光现象的观察

王彬彬　张翠萍　赵志力　付小兵　王 丽（.内蒙古自治区人民医院整形美容科，内蒙古 呼和浩特 0007；.解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室暨皮肤损伤修复与组织再生北京市重点实验室，北京 00048；. 北京军区总医院整形美容中心,北京 00700）



小汗腺自发荧光现象的观察

王彬彬1张翠萍2赵志力3付小兵2王 丽2
（1.内蒙古自治区人民医院整形美容科，内蒙古 呼和浩特 010017；2.解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室暨皮肤损伤修复与组织再生北京市重点实验室，北京 100048；3. 北京军区总医院整形美容中心,北京 100700）

【摘要】目的：观察小汗腺是否具有自发荧光现象及其随汗腺细胞生长、衰老的变化，推测其发光基团，探讨研究小汗腺的新方法。方法：取整形美容患者弃用的皮肤组织，苏木素染色，奥林巴斯倒置相差显微镜观察小汗腺组织的自发荧光现象。从皮肤中提取单个汗腺细胞进行体外培养，于汗腺细胞贴壁后7、14、21、28 d在奥林巴斯倒置相差显微镜分别以紫外光、绿光、蓝光3种不同激发光照射，观察小汗腺自发荧光的变化情况；利用激光扫描共聚焦显微镜γ扫描测量小汗腺自发荧光的强度。结果：苏木素染色后的小汗腺组织自发荧光表现为似有小孔的网状结构，小汗腺边界清晰，其自发荧光在蓝色激发光下表现为绿色自发荧光，绿色激发光下表现出红色自发荧光；单独的小汗腺细胞在荧光显微镜下表现出更多颜色的自发荧光，紫外光的激发下显示出蓝色的自发荧光，蓝色的激发光下显示出绿色自发荧光，绿色的激发光下显示出红色的自发荧光，随小汗腺的生长，荧光强度没有明显变化；用激光扫描共聚焦显微镜γ分层扫描方法测定小汗腺自发荧光强度，分别在近530 nm和590 nm处发现两个自发荧光峰值，与黄素和脂褐素的自发荧光峰值相近。结论：通过观察苏木素染色后小汗腺组织的自发荧光可以简单、快速地帮助判断小汗腺结构。单个汗腺细胞的自发荧光强度随汗腺生长没有明显减弱。根据小汗腺自发荧光的峰值测定初步判定小汗腺自发荧光的发光基团是黄素和脂褐素。

关键词小汗腺自发荧光荧光显微镜激光扫描共聚焦显微镜黄素脂褐素

自发荧光是组织固有的性质。皮肤自发荧光产生的原因在于皮肤组织中存在荧光基团，在某些病理变化中皮肤还会产生内源性和外源性的荧光基团[1-2]。人体的汗腺分为大汗腺与小汗腺两种，它们在调节人体生理活动中不可缺少。大汗腺主要分布于腋窝和生殖器部位的真皮深层，不参与体温调节。小汗腺分部在除了唇缘、甲床、乳头、生殖器外的皮肤组织，主要负责分泌汗液调节体温。对汗腺的深入研究可以提高对疾病状态（如无汗症或多汗症）下器官、组织、细胞和分子影响的认识[3-4]。因此，了解汗腺由不同疾病导致的功能和结构的变化具有重要临床意义。关于汗腺的生理病理指标以及汗腺损伤后的再生一直是科研难题，汗腺自发荧光现象也鲜有报道。我们曾经在离体汗腺细胞的培养中，观察到小汗腺在荧光显微镜下有自发荧光现象。本研究中，我们在奥林巴斯倒置相差显微镜下观察了小汗腺组织自发荧光的特点及其随汗腺细胞生长、成熟、衰老的变化，采用共聚焦扫描显微镜检测了小汗腺自发荧光强度，报告如下。

1　材料和方法

1.1实验仪器倒置相差显微镜及图像处理系统（奥林巴斯IX71，日本），显微镜自带3种激发光：蓝色激发光(430～500 nm),绿色激发光(500～560 nm),紫外线激发光(< 430 nm)。激光扫描共聚焦显微镜 (LCSM， Leica-SP8STWS，德国)。自发荧光淬灭剂C1212（北京普利莱技术有限公司)。

1.2皮肤组织中小汗腺组织自发荧光观察取北京军区总医院激光整形美容中心患者手术弃用皮肤组织，包括手部以及腹部皮肤，患者同意并签署知情同意书。 4例患者中男2例，女2例；年龄23~56岁。手术过程均严格禁止任何腐蚀性操作以免破坏汗腺组织。将新鲜皮肤组织剪成约1 cm×1 cm×1 cm的皮片，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋、 切片（厚5 μm），苏木素染色，倒置相差显微镜下观察皮肤组织中的小汗腺形态和其自发荧光特点。染色后的汗腺组织用蒸馏水冲洗后，放入平皿中，加入覆盖切片的淬灭剂，室温下孵育60 min ；吸去淬灭剂，蒸馏水短暂冲洗；吸去蒸馏水，PBS冲洗3次，奥林巴斯倒置相差显微镜下观察荧光是否具有特异性。

1.3分离培养小汗腺组织自发荧光的观察取新鲜皮肤组织去掉皮下脂肪层，D-Hanks液浸洗去除血液，剪成约1 mm×1 mm×1 mm的皮粒，放入60 ml培养皿中，加入5 ml（2 mg/ml）Ⅱ型胶原酶，混匀后置于37 ℃、5﹪CO2孵箱中8～12 h，倒置相差显微镜下用无菌移液枪。吸取游离的小汗腺细胞，分别置于普通培养皿以及Confocal皿中，加入配制好的汗腺培养基(在DMEM培养基的基础上，添加10%的胎牛血清，重组人表皮生长因子10 ng/100 ml,三碘甲状腺原氨酸2 nmol/ml,半琥珀酰氢化可的松0.4 µg/ml,胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠1 ml/100 ml,青霉素100 U/ml,链霉素100 µg/ml )， 48～72 h后汗腺细胞贴壁后每3 d更换1次培养基。于细胞贴壁后7 d，将装有贴壁汗腺细胞的培养皿置于倒置相差显微镜载物台上，分别以紫外光、蓝光、绿光照射汗腺团，观察小汗腺自发荧光图像，每隔7 d拍照，观察小汗腺自发荧光随汗腺细胞生长的变化情况，观察至汗腺细胞贴壁后28 d。

为了选择最优荧光观测区域，需要考虑到衰减可能性和保证适当的信号噪声比，首先在显微镜下选择一个合适的区域观察单独的小汗腺细胞，测定自发荧光的时机选择在肉眼观察荧光最明显时的激发光处。

1.4激光扫描共聚焦显微镜λ扫描当汗腺细胞贴壁以后，将种植于Confocal皿中的小汗腺细胞置于载物台，调整合适的视野和肉眼可见荧光最明显处的光圈大小，激光扫描共聚焦显微镜λ模式分层扫描，观察测量小汗腺自发荧光强度。

2　结 果

2.1汗腺组织自发荧光特点苏木素染色后的汗腺组织自发荧光表现为似有小孔的网状结构。小汗腺边界非常清晰,倒置相差显微镜蓝色激发光下绿色荧光和绿色激发光下红色荧光清楚,但紫外线下激发光没有显示自发荧光现象。荧光猝灭剂无法将荧光淬灭，表明汗腺自体荧光无特异性。图1（见封二）。2.2小汗腺生长过程中自发荧光变化从皮肤组织中分离出小汗腺进行培养，在荧光显微镜下在明敞视野下观察，并分别以紫外光、蓝光、绿光为激发光源照射汗腺，可以分别观察到蓝色、绿色以及红色的自发荧光，且各种自发荧光强度均较强，汗腺团结构清晰，可以清晰分辨出汗腺导管部，汗腺导管荧光强度部较其他部位稍强。汗腺细胞贴壁后7、14、21、28 d，肉眼观察到汗腺自发荧光随汗腺生长及衰老并没有明显变化。图2（见封二）。2.3激光扫描共聚焦显微镜λ扫描小汗腺荧光大小在激光扫描共聚焦显微镜λ模式分层扫描下，小汗腺表现出绿色自发荧光时，500～620 nm激发光范围内出现了两个自发荧光高峰，随机取图片中的6个点，根据其自发荧光值制图，发现峰值出现在近530 nm和590 nm处（图3,见封二）；在小汗腺表现出红色自发荧光时， 570～700 nm激发光范围内出现了一个自发荧光峰值，随机取图片中的6个点，根据其自发荧光值制图，其峰值出现在近590 nm处（图4，见封二）。上述峰值与黄素和脂褐素的自发荧光峰值相近[2]，推测引起小汗腺自发荧光的物质为黄素和脂褐素。

3　讨 论

当用一种波长的光照射某种物质时，这种物质得到光子，激发自身产生比照射光波长更长的可见光，这种现象称为自发荧光。在医学方面，自发荧光研究主要集中于视网膜疾病、呼吸系统肿瘤等相关疾病的病理过程研究、诊断和治疗[5-6]。

近年来，医学方面关于汗腺的研究主要集中在汗腺的再生与修复基因调控、相关蛋白和通道方面[7-12]，而关于汗腺光学特点的研究鲜有报道。组织中的自发荧光基团主要存在于细胞外基质中，如胶原纤维、弹力纤维、网状纤维中，而这些纤维组织是细胞构架的主要组成部分，我们猜测这些组织构架应该可以通过组织的自发荧光来观察到[2]，而且，通过研究小汗腺组织自发荧光图像来确定小汗腺的结构较光学显微镜观察简单、快速。我们的研究清楚地显示了皮肤组织中小汗腺在不同状态下的自发荧光现象，可以清晰地观察到绿色和红色的自发荧光,并且不会衰减，不能被荧光淬灭剂淬灭。可见,这种自发荧光具有非特异性[1-2]。

我们观察到，离体的汗腺细胞显示了不同颜色的自发荧光，而且随汗腺的生长、成熟和老化，荧光并没有明显改变，说明汗腺组织中引起自发荧光的物质没有随汗腺的新陈代谢而明显减少。细胞的自发荧光主要由内在荧光基团发出，如黄素和脂褐素等。黄素是在大多数代谢途径（如糖、蛋白质、脂肪和核酸的代谢通路）中必不可少的辅酶，其氧化和减少会产生不同量子产率。测量自发荧光可以用于监测细胞和组织能量代谢，反映细胞的新陈代谢水平[2,13]。采用激光扫描共聚焦显微镜测定，我们发现小汗腺自发荧光有两个峰值，分别接近于530 nm和590 nm。黄素参与细胞的呼吸链，其自发荧光来源于氧化反应，荧光峰值在520 nm；脂褐素是细胞老化的标志物，随着新陈代谢逐渐增加，其自发荧光峰值在近600 nm[2]，与所测小汗腺细胞峰值均相近。由于黄素和脂褐素的自发荧光峰值与本研究中所测得的小汗腺自发荧光峰值接近，因此推测引起小汗腺细胞发生自发荧光的物质很有可能是黄素和脂褐素。黄素随新陈代谢逐渐减少，脂褐素则随新陈代谢有所增加，这可能是小汗腺的自发荧光随新陈代谢没有明显变化的原因。

小汗腺自发荧光特点除了与自发荧光物质有关外，其他影响因素包括切片的厚度和光源选择[2,14]、生理病理情况、培养基以及温度等。本实验中，我们对所用到的器皿作了严格处理，以充分减少背景荧光对实验的干扰。我们观察所用的汗腺细胞均贴壁并且生长状态良好，各项操作均遵循了无菌操作原则。观察小汗腺自发荧光时严格控制时间以免造成汗腺细胞活性降低，影响实验结果。本研究结果显示，苏木素染色皮肤组织的自发荧光有助于帮助辨别小汗腺的组织结构。单个小汗腺表现出自发荧光现象可能是由于存在自身荧光基团—黄素和脂褐素，其与小汗腺新陈代谢的关系还需要进一步研究。

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Observation on autofl uorescence of eccrine sweat gland

Wang Binbin*, Zhang Cuiping, Zhao Zhili, Fu Xiaobing, Wang Li. * Department of Burns Plastic Surgery, Inner Mongolia People's Hospital, Hohhot, Inner Mongolia 010017, China Corresponding author: Zhao Zhili (E-mail: zhilizhao@vip.sina.com)
Zhang Cuiping(E-mail: zcp666666@sohu.com)

AbstractObjective: To observe the autofluorescence phenomena of eccrine sweat glands and its changes with the growth or aging of eccrine sweat glands, and speculate the endogenous fluorophores to provide a new method for the study of eccrine sweat glands. Methods: Abandoned skin tissues of patients receiving the plastic surgery were collected and stained with haematoxylin-eosin (HE) to observe autofluorescence of eccrine sweat glands under a fluorescence microscope. Single eccrine sweat gland was extracted from the skin of volunteers and cultured in vitro. At 7, 14, 21, 28 days after cell adherence, the autofluorescence was observed after the cells was exposed to three kinds of exciting light respectively, wide ultraviolet, wide green, and wide blue, under the fluorescence microscope. The autofluorescence intensity of the single eccrine sweat gland was measured using a laser confocal scanning microscope. Results: Autofluorescence of HE stained eccrine sweat glands showed net structure with ostioles, and the boundary was clear. The autofluorescence of the eccrine sweat glands appeared green under wide blue excitation light and red under wide green excitation light. Moreover, the single eccrine sweat gland cell showed three autofluorescence colours under fluorescence microscope, including blue under wide ultraviolet, green under wide blue light and red under wide green light. The fluorescence intensity of the single eccrine sweat gland cell didnot decrease significantly with its growth. The result of the intensity of single eccrine sweat gland detected by hierarchical scanning using the laser confocal scanning microscope showed that two peaks were located at approximately 530 nm and 590 nm, which were similar to those of flavin and lipofuscin. Conclusions: Autofluorescence of HE-stained eccrine sweat gland sections in skin tissue is helpful for simply and rapidly judging the structure of eccrine sweat glands. Autofluorescence of single eccrine sweat gland does not decrease significantly along with its growth. According to autofluorescence intensity of the eccrine sweat gland, it is thought that flavin and lipofuscin may be the endogenous fluorophores.

Key words:Eccrine sweat gland;Autofluorescence;Fluorescence microscope;Confocal laser scanning microscope;Flavin;Lipofuscin

DOI:10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 01. 003

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81571905）

通讯作者：赵志力，副主任医师（E-mail: zhilizhao@vip.sina.com）通讯作者：张翠萍，副研究员（E-mail: zcp666666@sohu.com）

收稿日期：（2015-12-25）