二代测序技术在乳腺癌分子生物学研究中的应用及进展

叶新星，康欣梅

(哈尔滨医科大学附属肿瘤医院 内三科，黑龙江 哈尔滨 150081)



·综 述·

二代测序技术在乳腺癌分子生物学研究中的应用及进展

叶新星，康欣梅

(哈尔滨医科大学附属肿瘤医院 内三科，黑龙江 哈尔滨 150081)

二代测序研究较为全面系统地检测了乳腺癌基因组，推进了对乳腺癌发生发展的认识。研究发现了新的驱动突变，总结了突变过程及机制，揭示了乳腺癌的瘤内异质性，并促进了个体化医疗的进展。本文作者综述二代测序技术在乳腺癌分子生物学领域的最新研究成果。

乳腺癌；二代测序；瘤内异质性；驱动基因；个体化医疗；综述

癌症的特点是积累的基因组异常，导致活化癌基因和灭活肿瘤抑制基因，这些差异表达基因被称为“驱动基因”。因此发现具有显著突变意义的基因对于明确癌症的成因、进展过程以及开发新的抗肿瘤治疗方法有着重要意义。二代测序技术使我们对乳腺癌分子生物学研究有了进一步认识，具体可以概括为3个方面：(1) 识别新的突变基因；(2) 了解基因突变过程及机制；(3) 探索肿瘤异质性并促进个体化医学发展。

1 显著突变基因的识别

在大量的基因突变中只有一小部分使得正常的细胞转化为有症状的癌细胞，这部分突变称为驱动突变。而大部分突变不赋予克隆增长的优势，并不为癌症发展贡献[1]，这些突变被称为“乘客”突变。通过二代测序技术对乳腺癌大量数据的分析已成功区分驱动突变和乘客突变，并确定了显著突变的基因[2]。这些癌症相关基因及其基因结构的改变可能有助于肿瘤的发生。

2012年二代测序技术的应用以及一系列具有里程碑意义的研究解开了乳腺疾病的突变景观，乳腺癌基因组学取得重大突破。Stephens等[3]通过对100例ER阳性和ER阴性的原发乳腺肿瘤患者进行外显子测序识别了7 241个体细胞突变点。Forbes等[4]证实了驱动基因的突变与乳腺癌的发展相关联，如AKT1、BRCA1、CDH1和GATA3、PIK3CA、PTEN、RB1、TP53、APC基因。与许多肿瘤相关的一些癌基因也存在窝藏驱动突变，更重要的是9个新的癌基因(AKT2、ARID1B、CASP8、CDKN1B、MAP3K1、MAP3K13、NCOR1、SMARCD1、TBX3)被确定，其中7个(除了AKT2和TBX3)是潜在的隐性癌易感基因[3]。AKT2基因被认为是激活的、显性作用的癌基因，而Tbx3基因突变对其功能的影响尚不清楚[3]。所有这些基因在细胞主要功能方面都扮演着重要的角色，如细胞增殖、DNA修复和转录调节。这项研究的一个有趣的发现是，几个不同的突变过程的出现导致乳腺癌JNK信号的失活，多功能激酶JNK参与许多生理过程，包括细胞的应激反应和细胞凋亡[5-6]。JNK通常作为JUN激酶的活化剂，JNK信号可以直接被MAP3K1、MAP2K4和MAP3K13的突变失活或废除[5]。此外，PIK3CA和PTEN突变可能导致通过激活Akt抑制JNK信号，也可以磷酸化和抑制MAP2K4[7]。这项研究的另一有意义的发现是不同的患者表现出不同的突变模式(体细胞突变的数量和类型)；这种多种分子机制的概念会引发乳腺癌在不同个体的发展，不同的乳腺癌患者呈现出多样化的临床表现，然而，在样本测试中没有突变总数和诊断年龄之间的相关性，这项研究表明启动驱动程序事件后乳腺癌基因组发生大量的基因突变[3]。

乳腺癌以雌激素受体(ER)、PR和Her-2受体的表达水平为依据分为管状A/B型(Luminal A/B)、基底样癌(basal-like)、正常样癌(normal-like)和Her-2过表达型[8]。这4种类型具有不同的基因表达特征，Luminal型乳腺癌具有ER的表达特征。Luminal A型乳腺癌是最常见的亚型，在乳腺导管内的腔上皮通常也具有高表达的基因如GATA3、FOXA1、Bcl-2以及低表达的和细胞增殖相关基因[9]。更为积极的表现型Luminal B型是罕见的，具有更高的组织学分级和增殖指数，它的特点是细胞腔基因的低水平表达和细胞增殖基因的高水平表达[9]。Her2过表达型乳腺癌通常高表达Her2和生长因子受体结合蛋白7(GRB7)，后者也位于17q21 Her2扩增子。基底样乳腺癌的基因签名包括低水平的ER受体表达或ER缺失，缺乏Her2过表达，表达的基因通常发生在基底或肌上皮细胞正常的乳房(细胞角蛋白5、6、17)和高水平表达的与细胞增殖相关的基因[8]。

Banerji等[10]对125例患者(4种主要亚型乳腺癌)进行DNA测序，外显子组测序证实了TP53、PIK3CA、AKT1、GATA3和MAP3K1基因的高频突变，也第一次证实了CBFB是乳腺癌有意义的突变[10]。突变CBFB只发现在ER+肿瘤，然而，由于样本太小，不能确定这种突变是否为ER+肿瘤特有。CBFB基因编码的异二聚体的β亚基核心结合转录因子，调节一组特定于造血[11]和成骨[12]的基因。RUNX1是CBFB的合作伙伴，被认为具有肿瘤抑制因子角色[13]。基于这些数据很容易推测，乳腺癌转录因子的失活可能与疾病的病因有关系，未来的研究应该致力于阐明其功能丧失的影响。

癌症基因组网络(TCGA)通过整合507例患者的基因组(DNA拷贝数与外显子)、转录组(基因和miRNA的表达)、表观基因组(DNA甲基化)和蛋白质组学数据，完整地研究了乳腺癌的分子特征[14]。510例乳腺肿瘤的全基因组测序分析确定了30 626个突变和生物信息学分析确定35个体细胞突变，包括在上述研究中所描述的基因，以及一些新的基因，除了PIK3CA(编码PI3K的催化亚基的基因)基因突变，还确定了PIK3R1(编码PI3K调节亚基的基因)基因突变。PI3K通路的所有重要的调节器PIK3R1、PIK3CA、PTEN和AKT1进行突变后相互排斥[14]。这项研究表明肿瘤的体细胞突变具有不同的突变模式。虽然管状乳腺癌体细胞突变率低于基底型乳腺癌和Her-2过表达型，但管状乳腺癌体细胞突变呈现最多样化和较高的复发率，这一发现表明这些突变基因在管状乳腺癌起着驱动作用。Luminal A型乳腺癌体细胞突变最常见的是PIK3CA(45%)，其次是MAP3K1、GATA3、TP53、CDH1和MAP2K4。Stephens等[3]认为MAP3K1和MAP2K4基因突变将导致JNK信号通路的失活或废除，这些突变间具有互斥性特点。Luminal B型显著突变的基因具有多样性的特点，TP53和PIK3CA(各占29%)是最常见的，其他一些TP53通路失活事件(ATM损失和MDM2扩增)也频繁地发生在这个亚型，相对于A亚型如果假定B型TP53通路失活就可以解释B亚型为更积极的表型。绝大多数基底样癌(80%)进行TP53基因突变，只有9%发生PIK3CA突变，细胞腔的显著突变基因则不存在。在Her2+亚型，频繁的Her2基因扩增(80%)，表现出混合模式的高频率的TP53(72%)和PIK3CA(39%)以及低频率的PIK3R1和PTEN基因突变。

肿瘤相关基因的识别一直是肿瘤研究的一个焦点，二代测序推动了乳腺癌基因组学的研究进展，这一过程的研究定会成为“精准医学”不可或缺的一部分[15]。

2 了解乳腺癌的突变过程及机制

全乳腺癌基因组测序使我们对乳腺疾病的突变过程有了进一步的了解。研究者应用二代测序技术在21例乳腺癌组织和正常组织中确定了183 916个体细胞发生碱基替换，在这些基因中存在驱动突变，如TP53、GATA3、PIK3CA、MAP2K4、SMAD4、MLL2、MLL3、NCOR1、ERBB2、CCND1、MYC、MDM2、ZNF217、ZNF703[16]。通过二代测序分析可以全面揭示遗传与环境变化在癌症基因组内留下的签名(与不同的DNA损伤和修复的分子机制相关)，每一个突变的过程都会在癌症基因组上留下一个标记，这是一个特定的突变类型的组合，这个突变的签名是由每一个突变过程暴露的强度和持续时间决定的[16]。以这种方式确定5种生物学上不同的单核苷酸替换过程，能观察到癌症之间突变数量和模式的变化(签名A-E)。签名A：主要特点是TpCpG三核苷酸序列上的C>T突变，也存在少量其他类型的突变。签名B:主要特征是TpCpX三核苷酸序列上的C>T、C>G和C>A突变，主要发生在10%的ER+肿瘤样本。签名C:XpCpG三核苷酸序列上适量的C>T、C>G突变及少量的C>A突变。签名D则表现出较均匀的分布。签名E主要特点是TpCpX三核苷酸序列上的C>G突变，签名E因此类似于签名B，但缺乏签名B中TpCpX三核苷酸序列上的C>T突变。该研究的主要发现是对病灶局部置换突变的检测，即雷雨(kataegis)。雷雨特点是C>T和(或)C>G突变，主要发生在TpCpX三核苷酸序列的同一DNA链上。雷雨灶包括几个到几千个突变，主要发生基因组重排。雷雨签名和签名B可能与APOBEC家族(载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽家族)成员胞苷脱氨酶有关，在碱基切除修复和DNA复制机制的共同作用下，胞嘧啶转换成尿嘧啶。随后的大型研究，检查了超过7 000个样本30种不同类型的癌症也表明APOBEC突变签名富集在肿瘤细胞[17]。APOBEC家族成员加剧亚克隆扩张和瘤内异质性，这可能代表了一种新的靶向药物，旨在限制肿瘤的演进、适应及耐药。

3 解剖瘤内异质性

乳腺癌所有可识别的形态和功能特征均可呈现瘤内异质性，反映的是多克隆的存在。研究者通过基因组测序研究揭示了乳腺癌瘤内异质性(相同的肿瘤类型不同患者之间的分子差异)。他们通过估算在散发肿瘤内检测到的突变事件的等位基因频率也发现了空间的瘤内异质性(原发肿瘤的不同区域之间的分子差异)。时间的瘤内异质性描述了在疾病的进展过程中肿瘤的进化，它是肿瘤自然发展过程中的遗传变异和抗癌治疗过程中产生的选择性压力的组合。

时间的瘤内异质性最广泛的研究形式涉及一个原发性乳腺癌及其相关的转移性病变随着时间的发展所产生的差异[17]。两个开创性研究试图通过深度测序理清这个问题[18-19]，Shah等[19]在一个原发乳腺小叶肿瘤并且9年后发生转移的患者身上证实了基因组畸变的存在。小叶乳腺癌ER+亚型，虽然具有高转移性，但可以在最初诊断后的许多年后复发，显示出良好的预后[20]。这项研究揭示了32个基因发生体细胞非同义突变参与乳腺癌的转移[19]，其中一些基因如CHD3、SP1、PALB2、ERBB2、USP28、klhl4、CDC6、kiaa1468、rnf220、COL1A1和SNX4在以前已被确定为乳腺癌的突变(但在不同的位置)，其余的在乳腺癌中首次被发现。32个基因中有11个也被发现在原发肿瘤中，而且11个中只有5个比较普遍，其余的则以较低的频率出现，这意味着这些特定的基因突变被限制在亚克隆肿瘤细胞。这些数据有力地表明，在癌症进展过程中发生了突变进化，然而目前还不清楚在乳腺癌转移过程中是否肿瘤自然进化或化疗的副作用会产生额外的突变。

基底样乳腺癌具有侵袭性，并由于缺乏靶向治疗，预后较差，往往遵循一个转移过程，最终导致死亡[21]。目前，还不清楚侵袭性表型的转移是否由最初发生在原发肿瘤的细胞突变驱动或由迁移到转移部位后的肿瘤细胞突变驱动。在2010年发表的一项研究通过对新辅助治疗一年后发生脑转移的原发乳腺癌患者进行基因测序解决了这个问题[18]。原发性肿瘤最显著的特点是突变的等位基因频率范围较宽，这意味着相当大的空间瘤内异质性。对于原发性肿瘤和转移性肿瘤的时间异质性，研究者在转移瘤中(并不出现在原发肿瘤)确定了2种从头合成突变，20个共享点突变，1个重要的染色体重排涉及FBXW7基因1个大杂合子的缺失，这种基因编码的蛋白质参与cyclin E和mTOR泛素介导的降解过程，如果这种功能缺失将导致染色体不稳定或肿瘤的发生[22]，此外CTNNA1基因水平双等位基因的缺失将导致乳腺癌细胞失去细胞黏附[23]，并增加致瘤的特征[24]。

虽然二代测序技术使我们对瘤内异质性有了初步的认识，但有可能混杂了克隆多样性，DNA和RNA的单细胞测序(SCS)方法为描述克隆多样性和理解罕见细胞在癌症进展的作用提供强大的新工具[25]。第一项研究使用这种技术结合流式细胞核技术，应用全基因组扩增和二代测序从三阴性乳腺癌个体细胞核内准确量化基因组拷贝数[26]。数据分析显示，拷贝数畸变不时地爆发，其次是稳定的克隆扩张，最终形成肿瘤。在随后的研究中，同一研究小组开发了一种新的测序方法，即核序列，应用于ER+浸润性导管癌和三阴性乳腺癌患者，观察肿瘤的突变景观。这是一种高覆盖、全外显子组单细胞测序的方法[27]。从细胞群体和单细胞测序数据显示三类的突变：(1)克隆突变，发现在总体样本和大多数单一肿瘤细胞；(2)亚克隆突变，发现仅在单一肿瘤细胞；(3)从头突变，发现仅在一类肿瘤细胞[27]。这些数据清楚地表明，即使在单细胞水平，也有着显著的肿瘤异质性，而且不同肿瘤的亚克隆是随着时间的推移积累不同的点突变的结果。

4 结 语

乳腺癌是一种异质性疾病，有着不同的组织学与病理学特征，具有复杂的分子生物学特征，具有多样的遗传与表观遗传突变，包括体细胞突变和DNA甲基化模式。二代测序技术临床应用的意义在于识别疾病的分子亚型、肿瘤异质性以及确定新的治疗靶点，为患者量身定制个体化治疗方案，为此二代测序技术在乳腺癌的诊断、预后及治疗中都起着着重要作用。下一步研究的重点将是通过二代测序技术为临床医生提供有用的和有效的信息进一步改善患者的预后水平。

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2016-03-01

2016-05-20

叶新星(1990-)，女，黑龙江哈尔滨人，在读硕士研究生。E-mail:290276584@qq.com

康欣梅 E-mail:kxm791107@163.com

叶新星，康欣梅.二代测序技术在乳腺癌分子生物学研究中的应用及进展[J].东南大学学报：医学版，2016，35(5)：813-816.

R737.9

A

1671-6264(2016)05-0813-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．038