3种检测肺炎支原体感染方法的比较分析

曹波，郁飞，张宪伟，陈红兵

(南京医科大学附属南京儿童医院 检验科，江苏 南京 210008)



·论 著·

3种检测肺炎支原体感染方法的比较分析

曹波，郁飞，张宪伟，陈红兵

(南京医科大学附属南京儿童医院 检验科，江苏 南京 210008)

目的:比较3种检测方法对肺炎支原体(MP)感染的临床诊断效果及应用价值。方法：对疑为呼吸系统MP感染的494例住院患儿留取痰液，用PCR荧光探针法进行MPDNA检测，用被动凝集法和间接免疫荧光法进行血清抗MP抗体检测。结果：PCR荧光探针法阳性299例(60.53%)，被动凝集法阳性290例(58.70%)，间接免疫荧光法阳性242例(48.99%)，PCR荧光探针法与被动凝集法的阳性率无差别(χ2=0.341,P>0.012 5)，间接免疫荧光法与PCR荧光探针法(χ2=13.274,P<0.012 5)、被动凝集法(χ2=9.383,P<0.012 5)阳性率相比，差异均有统计学意义。被动凝集法阳性结果中滴度为40的患儿共77例，其中70例的另2种方法结果均为阳性。结论：间接免疫荧光法的检测阳性率低于PCR荧光探针法与被动凝集法。对于儿童，被动凝集法静脉血标本的采集较PCR荧光探针法的痰标本采集更为简便，可将被动凝集法作为MP感染的门诊筛查项目；被动凝集法应将滴度≥40的结果判定为阳性。

肺炎支原体；PCR荧光探针法；被动凝集法；间接免疫荧光法

肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)是儿童时期肺炎或其他呼吸道感染的重要病原体之一，并可有复杂的肺外表现[1]。MP感染的治疗与其他细菌和病毒感染的治疗方案截然不同，及时、有效地进行MP感染的实验室诊断对指导临床治疗，进而预防可能发生的医院内流行和并发症十分重要[2-3]。我们采用PCR荧光探针法(PCR fluorescence probing)、被动凝集法(passive particle agglutination)、间接免疫荧光法(IFA)3种常用MP感染实验室诊断方法对疑似MP感染患儿做平行检测，期望能为临床医师提供准确的MP感染实验诊断方法。

1 对象和方法

1.1 研究对象

2014年11月至2015年3月我院呼吸科疑为呼吸系统MP感染的住院患儿共494例，其中男312例(63.16%)，女182例(36.84%)。

1.2 PCR荧光探针法定量检测MP

MP核酸定量检测试剂盒由中山大学达安公司提供。使用一次性吸痰器采集患儿气管深部分泌物1～3 ml作为痰液标本，用4倍体积40 g·L-1的NaOH室温消化30 min，取1 ml至离心管，15 000 r·min-1离心5 min，用生理盐水离心洗涤1次，弃上清，加50 μl DNA提取液，混匀，沸水浴10 min，10 000 r·min-1离心5 min，取上清液2 μl做PCR检测。反应管置于美国应用生物系统公司PE5700自动荧光检测仪，93 ℃预变性2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 120 s，40个循环。荧光激发波长为487 nm，检测波长为525 nm。反应结束，计算机自动分析结果，以拷贝≥5×102为阳性。

1.3 被动凝集法检测抗MP抗体

按富士瑞必欧株式会社提供的抗MP抗体检测试剂盒说明书对患儿血清进行检测，滴度≥40为阳性。

1.4 间接免疫荧光法检测抗MP抗体

按VIRCELL公司提供9项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒说明书对患儿血清进行检测。

1.5 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行3种方法的阳性率比较，用R×2表资料χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。若有差异，再用χ2分割法(partitions ofχ2method)重新规定检验水准，通过3个独立的四格表资料χ2检验行两两比较，来判断各方法间的阳性率是否有差别。

2 结 果

494例受检患儿中，PCR荧光探针法阳性299例，阳性率60.53%；被动凝集法阳性290例，阳性率58.70%；间接免疫荧光法阳性242例，阳性率48.99%。对3种方法的阳性率行R×2表资料χ2检验，差异有统计学意义(χ2=15.434，P<0.01)。再用χ2分割法，将检验水准重新规定为α′=0.012 5，通过3个独立的四格表资料χ2检验行两两比较，结果显示间接免疫荧光法与PCR荧光探针法(χ2=13.274，P=0.000)、被动凝集法(χ2=9.383,P=0.002)的阳性率差异均有统计学意义，但PCR荧光探针法与被动凝集法的阳性率差异无统计学意义(χ2=0.341，P=0.560)。

被动凝集法阳性结果中滴度为40的患儿共77例，占此方法所有阳性标本的26.6%，其中70例的另2种方法结果均为阳性。

各年龄段3种方法所测MP或抗MP抗体阳性率差异均有统计学意义(均P<0.01)，见表1。

表1 各方法不同年龄段MP或抗MP抗体阳性 例

3 讨 论

MP的分离培养和鉴定可客观反映MP感染的存在，作为传统的检测手段，至今仍是支原体鉴定的金标准，但费时耗力。MP对培养条件要求苛刻，生长缓慢，做出判定需3～4周。当标本中MP数量极少、培养基营养标准不够或操作不当时，均会出现假阴性[3]。目前临床实验室诊断多采用血清学方法和PCR方法。由于PCR技术的不断进步，以标记特异性荧光探针为特点的荧光定量PCR技术，完全闭管式操作，大大减少了扩增产物污染的机会，使其同时具备良好的灵敏度和特异性，并可对扩增产物进行精确定量[4-6]。本实验中荧光定量PCR方法的阳性率高于其他两种方法。被动凝集法的阳性率与荧光定量PCR的相比，差异无统计学意义，也是一种高效方法。儿童咳痰能力较差，PCR法多采用吸痰方式来采集标本，而吸痰操作要求高，只适用于症状较重有吸痰需要的住院患儿。被动凝集法以取样较为容易的静脉血清作为标本，且实验用时仅3 h，可单个标本检测，更适合用于门诊疑似MP感染患儿的筛查。与这两种方法相比，间接免疫荧光法的阳性率较低，将影响其对MP感染的诊断效率。

在使用被动凝集法来检测支原体抗体时，由于儿童抽血依从性差，较难实现双份血清恢复期抗体滴度上升4倍或下降为原来的1/4的诊断标准，临床上多用单份血清来检测。黄海辉等[7-8]认为应将单份血清抗体滴度≥80或≥160作为血清学诊断标准;而本实验被动凝集法滴度为40的阳性标本共77例，占所有阳性标本的26.6%，其中70例得到本实验另2种方法的验证，7例呈阴性。用被动凝集法测定抗MP抗体时，须注意其所测得的抗体90%为抗MP-IgM，但也包含了10%左右的抗MP-IgG。故我们认为，对于被动凝集法抗体滴度为40阳性的标本，应引起临床重视并结合患儿临床症状、既往感染情况、影像学检查、PCR及其他血清学检查结果综合判断，不能简单地将滴度为40作为排除MP感染依据。

与其他MP感染的流行病学报道相似，本项调查显示随着年龄的增加，MP阳性率明显增加(P<0.01)，但由于研究对象均为住院疑似MP感染并同时进行3种方法检查的患儿，所以整体阳性率较高，能印证儿童MP感染率随年龄增高的趋势，但不能作为流行病学研究依据。

目前国内外常见的MP感染检测方法包括培养法、血清学方法和PCR方法。由于培养法的局限性，临床并不常用，故临床应结合血清学和PCR方法的优缺点，联合用于临床诊断。若血清学检测阴性而PCR阳性，可能血清学检查时间过早，患者体内抗体尚未产生，甚至部分患者不能产生抗体；当血清学方法阳性而PCR阴性时，须考虑近期是否已发生过支原体感染以及血清学检测假阳性的可能。总之，在诊断MP感染时，可将被动凝集法作为MP感染的病原学筛查项目，将PCR方法作为补充，并结合临床症状和治疗效果综合判断，争取较早的明确诊断。

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2016-01-20

2016-05-23

曹波(1982-)，男，江苏南京人，主管检验师。E-mail:22309437@qq.com

曹波，郁飞，张宪伟，等.3种检测肺炎支原体感染方法的比较分析[J].东南大学学报：医学版，2016，35(5)：770-772.

R563.15

A

1671-6264(2016)05-0770-03

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．027