狼疮肾炎蛋白质组学和代谢组学的研究进展

李鞠，谈文峰，孟德钎，唐凤英，张缪佳

(1.南京医科大学第一附属医院 风湿免疫科，江苏 南京 210029；2.南京医科大学附属淮安第一医院风湿免疫科，江苏 淮安 223300；3.南京医科大学附属淮安第一医院 肾内科，江苏 淮安 223300)



·综 述·

狼疮肾炎蛋白质组学和代谢组学的研究进展

李鞠1，2，谈文峰1，孟德钎2，唐凤英3，张缪佳1

(1.南京医科大学第一附属医院 风湿免疫科，江苏 南京 210029；2.南京医科大学附属淮安第一医院风湿免疫科，江苏 淮安 223300；3.南京医科大学附属淮安第一医院 肾内科，江苏 淮安 223300)

狼疮肾炎(LN)是系统性红斑狼疮(SLE)最严重的表现之一，肾脏损害的严重程度与SLE的预后密切相关。LN发病涉及到多种因素，包括遗传易感性、表观遗传调控和环境。近十来年基于组学的技术(包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学)已广泛地用于SLE及LN生物标志物筛选和疾病的分型分类。这些研究深化了我们对疾病分子基础的认识，对识别潜在治疗靶点、疾病的早期预测及治疗非常重要。本文作者就最近几年狼疮肾炎蛋白质组学及代谢组学的相关研究进展作一综述。

狼疮肾炎；蛋白质组学；代谢组学；标志物；综述

系统性红斑狼疮(SLE)是一种以多种自身抗体产生，累及重要器官包括肾、脑、心血管、关节和皮肤等部位的慢性自身免疫性疾病。狼疮肾炎(LN)是SLE中最常见的并发症，是SLE患者的主要死因之一[1]。其发病机制包括肾小球内自身抗体的沉积、补体和巨噬细胞的活化、细胞增殖及细胞外基质蛋白的产生、促炎症细胞因子和趋化因子聚集、多种机制共同引起肾小管损害以及肾间质炎症和纤维化。迄今，LN作为SLE严重的并发症之一，仍然是一个重大的挑战[2]。寻找可靠的LN的生物标志物，将有助于评估病情、确定肾脏损伤风险指数并促进早期诊断和干预以改善预后[3]。连锁分析和全基因组关联研究(GWAS)筛选揭示狼疮一部分易感基因位点[4-5]，但这些位点只占疾病遗传的一小部分。人类疾病广泛存在表观遗传机制，包括DNA的甲基化以及组蛋白和微小RNA的改变等，这些变化最终形成不同级别的蛋白质和小分子代谢生物标志物。

1 蛋白质组学

蛋白质组学(proteomics)，即高通量地确定某一细胞、组织或器官的全套蛋白质的特征，包括表达水平、结构及功能的特征等。通过对比正常人群、LN患者以及不同亚类LN患者之间体液或组织表达谱，筛选出差异表达的蛋白质，可能对疾病诊断、病情判断及预后估计有重要的价值，并可进一步探讨疾病的发病机制。

1.1 血清蛋白组学

Morgan等[6]采用表面增强激光解吸电离(SELDI)结合质谱技术分析了LN患儿与同性同龄正常对照组血清蛋白表达谱的差异，筛选出一个由5个亚基(相对分子质量分别为22、23、44、79和100 000)构成的蛋白质在LN患儿中明显高于对照组，该差异蛋白对诊断的敏感型和特异性均在90%以上。Serada等[7]应用二级双向电泳液相色谱—串联质谱的方法鉴定出醛缩酶A是LN患者血清标志物。有研究[8]应用48丛抗体芯片检测LN血清标志物，结果显示早期LN患者中血清补体C1q降低，白细胞介素-6和低密度脂蛋白增加。一种多重蛋白微阵列[9]用来分析LN患者及LN小鼠模型血清中的自身抗体并被推断是发现新的自身抗体的有利工具。Bruschi等[10]洗脱来自LN患者肾小球激光捕获的抗体，用双向电泳与足细胞蛋白质免疫印迹反应，结合光谱质谱及基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱的技术发现11种差异蛋白质并验证了烯醇酶和膜联蛋白A1两种抗原蛋白质。

1.2 尿蛋白组学

尿液具有获取简便、无创伤性、能大规模重复取样并与肾脏功能密切相关等特点。表面增强激光解吸离子时间飞行质谱技术的发展，多个样本可同时检测，所需尿液量少(5～10 μl)，并能检测低于20 kDa的低分子质量蛋白质，使得关于LN尿液蛋白质组学的研究日益增多[11-13]。表面增强激光解吸电离蛋白质芯片飞行时间(SELDI-TOF)主要的缺点就是可以识别蛋白形态但不能确定具体为哪一种蛋白质。通过SELDI-TOF质谱最初筛选，利用集成芯片上的蛋白质测序或液相色谱串联质谱法LC/MS/MS可以鉴定具体的蛋白质[14]。

Suzuki等[15]应用基质辅助激光解析电离飞行时间(MALDI-TOF)法检测出LN患儿尿中转铁蛋白、铜蓝蛋白、α-酸性糖蛋白(AGP)、脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(L-PGDS)、白蛋白和白蛋白相关片段表达异常并与疾病活动度相关，其中转铁蛋白、α-酸性糖蛋白、脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶在患者出现临床症状之前便显著升高。然而，Suzuki等并没有分析这些蛋白质是否与狼疮的不同病理类型相关。Oates等[16]采用经典2DE结合MALDI-TOF的方法鉴定出α-酸性糖蛋白具有诊断LN的高敏感性。但有学者发现AGP和L-PGDS亦是成人糖尿病肾病的预测指标[17]，表明这两种蛋白不是LN的特有指标。Lee等[18]用SELDI-TOF的方法发现，肝杀菌肽20和血清蛋白碎片的排泄在LN发生4个月前便显著上升，而肝杀菌肽26在疾病发生时排泄减少，证实了上述一些蛋白质可作为LN的标志物。Mosley等[19]用SELDI-TOF的方法区分活动期和静止期LN患者，质荷比为3 340和3 980的两种蛋白质在两组病例中的排出量具有显著差异，但没有得到更进一步的验证。Zhang等[11]发现LN 3种低分子潜在标志物，分别是肝杀菌肽的20和25氨基酸亚型、白蛋白及1-α抗胰蛋白酶碎片。其中，肝杀菌肽与LN患者体内的促炎症细胞因子密切相关。肝杀菌肽由白介素-6和肿瘤坏死因子调节，并参与LN的发生发展[20]。肝杀菌肽20在病情复发前4个月浓度增加，而肝杀菌肽25在病情缓解后含量回到基线水平，表明肝杀菌肽20可以用来预测病情复发，而肝杀菌肽25可能是治疗有效的标志物。

Varghese等[21]结合MALDI-TOF MS和人工神经网络分析发现11种尿蛋白与局灶阶段性肾小球硬化，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型LN及糖尿病肾病相关。此外，这些蛋白质区分LN和局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病、糖尿病肾病的敏感性和特异性分别为86%、89%。他们分别是AGP、转铁蛋白、α-1-微球蛋白、锌α-2糖蛋白-1-抗胰蛋白酶、B补充因子、触珠蛋白、甲状腺素运载蛋白、血浆视黄醇结合蛋白、白蛋白和血液结合素，但这个研究结果没有在随后的人群中重复出来[22]。

Wu等[23]用2D凝胶电泳的方法分离出LN小鼠尿中的71种差异表达蛋白质，并验证了4种蛋白质标志物为前列腺素D合成酶(PGDS)、肾素或总蛋白酶、血清淀粉样蛋白(SAP)以及超氧化物歧化酶(SOD)。LN患者尿液中PGDS和酶分解产物PGD2、SOD、总蛋白酶以及SAP升高，并与肾脏病理类型相关。这4种代谢产物预测肾小球肾炎积分及病理活动指数优于传统的指标24 h尿蛋白和尿素氮，其中总蛋白酶具有最强的疾病活动相关性。

1.3 肾脏组织蛋白质组学

LN病理类型多样，可表现为慢性肾炎综合征、肾病综合征甚至急进性肾炎，病程呈慢性缓解和急性发作交替的特点，直接影响其预后。目前主要依靠肾脏穿刺活检病理检查对LN进行分级分期，但肾活检有创伤性，较多患者不接受，少部分患者存在肾活检禁忌证，且活检取材对早期肾病变的灶性、轻微阶段也存在一定的漏诊率。因此，对早期狼疮性肾炎患者进行蛋白质组学检查，寻找特异性生物标志物，对狼疮肾脏病变的早期认识及确定分型分期是十分重要的内容。Sui等[24]应用定量蛋白质组学技术对Ⅴ型LN肾组织中的“全组”蛋白进行鉴定和定量分析，与正常对照组比较，实验肾组织中共筛选出10个明显上调蛋白和8个明显下调蛋白，并鉴定出上调蛋白中的不均质核内核糖核蛋白、核纤层蛋白A、膜联蛋白和下调蛋白中的精氨(基)琥珀酸合成酶、醛缩酶等参与LN的潜在致病过程。Alaiya等[25]应用二维凝胶双向电泳(2-DE)和质谱分析蛋白组方法结合检测Ⅳ型LN(弥漫增殖和局灶阶段)、抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎及正常肾组织4组样本，结果显示无法区分弥漫增殖和局灶阶段硬化组，但建立的主成分分析(PCA)模型能显著区分Ⅳ型LN组与抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎及正常肾组织组。目前关于狼疮肾脏组织蛋白质组学的研究尚少，需要更多的动物及临床实验来进一步深入探讨。

2 代谢组学

代谢组学是一门研究生物体样本或器官的小分子代谢产物的科学。通过代谢组学的研究不仅可以了解LN病变的发生、发展以及治疗过程中机体的状态和变化，还可以探索外界干扰因素(微生物、环境、饮食、药物、毒物及生活方式等)对患者的影响，为LN的诊断、防治、病理机制的探索、临床治疗方案的评价甚至新治疗靶点的发现提供了新的途径和思路。

2.1 血清代谢组学

LN作为SLE的最常见的并发症，其体内代谢组谱应该有和SLE相似之处。第一个研究SLE代谢组学是应用LC/MS和气相色谱质谱(GC-MS)联合的方法发现SLE患者存在血清中能量产物的减少、氧化应激产物增多、炎症活性标志物升高以及脂质代谢紊乱[26]。另一个则采用核磁共振光谱分析发现SLE患者血清中能量产物减少，低密度脂蛋白和乳酸增加[27]。近来Nowling等[28]通过代谢组学方法发现狼疮小鼠及LN患者中糖磷脂代谢紊乱，提示糖磷脂通路可能成为LN的早期诊断标志物。后续的研究可以直接围绕寻找调节磷脂代谢通路的治疗靶点以延缓LN患者的动脉粥样硬化血管病变进程。此外，通过代谢组学确定循环血液中活性鞘脂类水平[29]并在临床实验室进行验证可能成为SLE诊断和估测预后的重要方法。糖组学包括游离糖及结合蛋白或脂类的糖的研究，研究碳水化合物对自身免疫性疾病的影响是一个新颖具有希望的领域[30-31]。

2.2 尿液代谢组学

Romick-Rosendale等[32]发现，牛磺酸和柠檬酸这两个尿液中的代谢产物能够准确地将增生性(LN Ⅲ/Ⅳ型)和单纯系膜病变LN(Ⅴ型)患者区分开。Ⅲ/Ⅳ型LN患者尿液中的牛磺酸浓度比Ⅴ型患者低10倍多(P<0.01)。而Ⅴ型LN患者尿液中的柠檬酸浓度比Ⅲ/Ⅳ型患者低8倍多(P<0.05)。此外，尿液中的马尿酸盐能将该盐浓度处于正常水平的Ⅴ型患者与完全缺乏该盐的FSGS患者区分开(P<0.001)。牛磺酸和柠檬酸等是检测肾小管细胞功能的标志物[33]。肾脏通过对代谢物进行过滤和重吸收以维持代谢平衡，肾脏病变使肾小球和肾小管对牛磺酸和柠檬酸等小分子代谢物的过滤和重吸收发生紊乱，从而使得代谢图谱存在差异[34]。鲁莹等[35]采用基于1H-NMR的代谢组学的方法，利用PCA进行小鼠的尿液与血清代谢组数据分析，指出中药昆仙胶囊可降低狼疮肾炎MRL/lpr小鼠尿中乳酸、柠檬酸、葡萄糖、谷氨酰胺及丙氨酸水平，并升高α-酮戊二酸、肌酸/肌酐、马尿酸盐的水平。

3 结 语

LN是一种临床和血清学多样性的自身免疫性疾病，其发病机制复杂，很难用单一的生物学标志物来说明LN广泛的特性，合适的生物学标志物对于LN早期诊断、治疗靶点选择和判断预后具有重要价值。蛋白质组学和代谢组学技术结合模式识别分析方法构建机体整体的蛋白差异表达图谱或代谢指纹图谱以区分疾病的病理状态，比传统的单一标志物更有利于疾病的诊断和疗效的监测。蛋白质组及代谢组学的发展为阐明LN的发病机制、判断疾病不同病理类型及寻找新的药物治疗靶点提供新的思路。

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2016-03-17

2016-05-23

国家自然科学青年基金资助项目(81102684)

李鞠(1984-)，女，江苏泗洪人，主治医师，在读博士研究生。E-mail:liju198461@163.com

张缪佳 E-mail:mjzhang@njmu.edu.cn

李鞠，谈文峰，孟德钎，等.狼疮肾炎蛋白质组学和代谢组学的研究进展[J].东南大学学报：医学版，2016，35(5)：789-792.

R593.2

A

1671-6264(2016)05-0789-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．032