葛根总黄酮磷脂复合物制备工艺的研究*

黎 迎，宋轶群，张 运，朱春燕

（中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193）

葛根总黄酮磷脂复合物制备工艺的研究*

黎 迎，宋轶群，张 运，朱春燕＊＊

（中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193）

目的：优选葛根总黄酮磷脂复合物最佳成型工艺。方法：以磷脂复合物的复合率和表观油水分配系数为指标，采用单因素正交试验优化葛根总黄酮磷脂复合物处方。结果：优选出制备工艺的最佳条件：葛根总黄酮和大豆卵磷脂质量比为1:4，反应溶剂为甲醇，葛根总黄酮的浓度为4 mg·mL-1，反应温度为55℃，反应时间为2 h。按得到的优化条件制备的磷脂复合物的复合率为102.98%；pH=3时，Papp=0.392；pH=6.8时，Papp=0.323；综合得分为95.11分。结论：优化所得葛根总黄酮磷脂复合物处方合理，复合率高，油水分配系数增高，脂溶性得到改善。

葛根总黄酮 磷脂复合物 制备工艺 正交试验

药物的油水分配系数（log P）可用于预测药物的吸收，肠道不同部位对药物吸收所需要的油水分配系数不同，胃肠道适宜吸收的油水分配系数值的范围是0.3-2.0。对葛根总黄酮的理化性质的研究发现，葛根总黄酮中葛根素在各生理pH下的log P值均小于零，说明其极性大，亲脂性弱，透膜吸收存在困难，为胃肠道吸收较差的原因之一。

磷脂的乳化作用可提高葛根素在大鼠离体肠管吸收量的2-4倍，乳剂凭其脂溶性而易于通过生物膜是提高葛根素生物利用度的物理化学基础[1-4]。磷脂可提高葛根素的生物利用度，有利于葛根素通过生物膜进入靶器官[5-8]。因此，本研究期望通过将葛根总黄酮制成磷脂复合物来提高葛根总黄酮的表观油水分配系数，从而得到脂溶性高的葛根总黄酮制剂，增强透膜吸收。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HC-188加热循环器（Shishim公司）；VV2000旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；UGC-12MF氮吹仪（北京优晟联合科技有限公司）。

1.2 试药

葛根素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110752-200511）；葛根总黄酮提取物（本室自制，批号：040120）[9]；大豆磷脂酰胆碱（德国Lipoid公司，批号：S100）。

2 方法与结果

2.1 磷脂复合物的制备

将葛根总黄酮和卵磷脂溶于10 mL溶剂中，控制一定的反应温度和反应时间，500 r·min-1水浴循环搅拌加热，反应完毕后，在70℃条件下以60r·min-1旋转蒸发除去反应溶剂，再加入2.0 mL氯仿，充分溶解其中的磷脂及磷脂复合物（葛根总黄酮在CHCl3中不溶，磷脂及磷脂复合物溶于CHCl3），用0.45 μm有机滤膜过滤，收集滤膜上的沉淀，干燥并称重。同时取续滤液于70℃，60 r·min-1旋转蒸发蒸干。

2.2 葛根总黄酮中葛根素的高效液相色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）。流动相为：乙腈（A）- 0.05%醋酸水（B），梯度洗脱（0-20 min，10%A；20-30 min，20%A；30-40 min， 30%A；40-50 min，40%A；50-75 min，10%A），波长为254 nm，温度为40℃，流速为1.0 mL•min-1，进样量为20 μL。

图1 不同溶剂的磷脂复合物的复合率（n=3）

图2 不同溶剂的磷脂复合物的表观油水分配系数（n=3）

图3 不同反应时间对磷脂复合物复合率的影响（n=3）

2.3 称重法考察复合率

葛根总黄酮的初始投药量（g）与沉淀量（g）的差值即为磷脂复合物中葛根总黄酮的量，从而计算葛根总黄酮与磷脂的复合率。

复合率（%）=（葛根总黄酮的初始投药量-沉淀量）/葛根总黄酮的初始投药量×100%

2.4 表观油水分配系数

取复溶于CHCl3中的磷脂复合物溶液100 μL，氮气吹干，加入4 mL不同pH（pH 2.94，6.88）水饱和的正辛醇溶液，涡旋，超声，使之溶解。取2 mL此液，分别加入2 mL不同pH正辛醇饱和的水溶液，涡旋5 min，置于37℃的恒温水浴振荡器中振摇24 h，取出后静置30 min，3 000 r·min-1离心10 min，分别取上下层溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，用HPLC测定萃取后油相、水相中的葛根素（占总黄酮17.93%）浓度，计算公式如下：

logP =log（Co/ Cw）

其中Co（μg·mL-1）为萃取后油相中的药物浓度，Cw（μg·mL-1）为萃取后水相中的药物浓度。

2.5 处方因素的研究

2.5.1 溶剂种类考察

葛根总黄酮与卵磷脂的投料比为1:2（质量比）时，葛根总黄酮浓度为2 mg·mL-1，反应温度为50℃，反应时间为2 h，旋转蒸发去除反应溶剂，以磷脂复合物的复合率和表观油水分配系数为评估标准，对甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯进行考察，优选出最佳反应溶剂，复合率和表观油水分配系数结果分别见图1和图2。

由图1可知，不同溶剂制备的磷脂复合物复合率的大小为：THF＞甲醇＞丙酮＞二氯甲烷＞乙醇＞氯仿＞乙酸乙酯，其中THF、甲醇、丙酮、二氯甲烷为溶剂制备的磷脂复合物的复合率均在90%以上，且无显著性差异（P＞0.05）。由于甲醇作为溶剂时，复合率在90%以上，且在pH=3时的表观油水分配系数最大，故选择甲醇作为溶剂。

2.5.2 不同反应时间的考察

选定反应溶剂为甲醇后，设定葛根总黄酮与卵磷脂的投料比为1:2（质量比），葛根总黄酮浓度为2 mg·mL-1，反应温度为50℃，旋转蒸发去除反应溶剂，分别考察反应时间为0.5、1、1.5、2、3、4 h的磷脂复合物的复合率和表观油水分配系数，结果分别见图3、图4。

由图3可知，随着反应时间的增加，磷脂复合物的复合率先增加后降低，在反应时间为2 h时达到最高值93.27±3.06%。

图4 不同反应时间对磷脂复合物表观油水分配系数的影响（n=3）

由图4可知，随着反应时间的增加，磷脂复合物的表观油水分配系数呈现先增加后降低的趋势，在反应时间为2 h时达到最高值，综合反应时间对磷脂复合物复合率的影响，因此筛选反应时间为2 h。

2.5.3 不同反应温度的考察

选定反应溶剂为甲醇，反应时间为2 h后，设定葛根总黄酮与卵磷脂的投料比为1:2（质量比），葛根总黄酮浓度为2 mg·mL-1，旋转蒸发去除反应溶剂，考察于不同反应温度（37、50、55℃）下磷脂复合物的复合率和表观油水分配系数。结果分别见图5、图6。

由图5可知，随着反应温度的增加，磷脂复合物的复合率呈增加趋势，但反应温度为50℃时和55℃时，磷脂复合物的复合率无显著性差异（P＞0.05），且反应温度为50℃时，磷脂复合物的复合率就已经达到90%以上，故考虑到节约能源，选择反应温度为50℃即可。由图6可知，随着反应温度的增加，pH=3和pH=6.8条件下磷脂复合物的表观油水分配系数均呈现先升后降的趋势，在温度为50℃时，达到最高值，因此筛选反应温度为50℃。

2.5.4 不同反应物浓度的考察

选定反应溶剂为甲醇，反应温度为50℃，反应时间为2 h，设定葛根总黄酮与卵磷脂的投料比为1:2（质量比），旋转蒸发去除反应溶剂，考察反应物葛根总黄酮浓度（2、4、6 mg·mL-1）对磷脂复合物复合率和表观油水分配系数的影响，结果分别见图7、图8。

由图7可知，随着反应物浓度的增加，复合率无显著性差异（P＞0.05）。由图8可知，当反应物浓度为2 mg·mL-1时，磷脂复合物的表观油水分配系数最大，因此筛选反应物浓度为2 mg·mL-1。

2.5.5 不同投料比的考察

选定反应溶剂为甲醇，反应温度为50℃，反应时间为2 h，葛根总黄酮浓度为2 mg·mL-1，旋转蒸发去除反应溶剂，考察不同投料比（1:4，1:2，1:1，2:1，4:1）对磷脂复合物复合率和表观油水分配系数的影响，结果分别见图9、图10。

图5 不同反应温度对磷脂复合物复合率的影响（n=3）

图6 不同反应温度对磷脂复合物表观油水分配系数的影响（n=3）

图7 不同反应物浓度对磷脂复合物复合率的影响（n=3）

图8 不同反应物浓度对磷脂复合物表观油水分配系数的影响（n=3）

图9 不同投料比对磷脂复合物复合率的影响（n=3）

图10 不同投料比对磷脂复合物表观油水分配系数的影响（n=3）

表1 正交设计的因素与水平的确定

由图9可知，当葛根总黄酮与卵磷脂的投料比为1:2时，磷脂复合物的复合率最大，为102.45%，因此选择投料比为1:2。由图10可知，随着葛根总黄酮比例的增大，磷脂复合物的表观油水分配系数呈现先增大后降低的趋势。当葛根总黄酮与卵磷脂的投料比为1:2时，pH=3和pH=6.8条件下磷脂复合物的logP均为最高，分别为-0.484和-0.384，因此筛选投料比为1:2。

2.6 正交设计优化磷脂复合物处方

2.6.1 正交设计的因素与水平的确定

根据单因素考察的实验结果，反应物的质量浓度（mg·mL-1）、反应投料比和反应温度（℃）对复合率和表观油水分配系数影响较大，根据预实验确立各因素的考察范围。因此，以复合率和表观油水分配系数为指标，对A（反应物的浓度）、B（反应投料比）、C（反应温度）作三因素三水平的正交实验设计，反应溶剂为甲醇，反应时间为2 h，采用L9（34）表。

2.6.2 正交实验设计方案与结果

由表1可知，按照正交表L9（34）安排了9 次实验，以复合率和油水分配系数为指标对磷脂复合物质量进行考察，采用综合加权评分法，将多指标转化为单一指标。正交实验设计表和方差分析结果分别见表2、表3。其中，复合率（f1）指标公式如下：

f1=（葛根总黄酮的初始投药量-沉淀量）/葛根总黄酮的初始投药量×100

表观油水分配系数公式：

f2=Papp（pH=3）/Pappmax（pH=3）×100

f3=Papp（pH=6.8）/Pappmax（pH=6.8）×100

式中Papp为各处方测得的平均表观油水分配系数，Pappmax为测得的最大表观油水分配系数。综合指标公式：

根据极差及方差分析可知，各因素对总分的影响依序为A＞C＞B，反应物浓度对总分的影响最大，但各因素的影响无统计学意义（P＜0.05）。由表2、表3可知，拟定优化处方为A2B1C3，即反应物浓度为4 mg·mL-1，葛根总黄酮/磷脂=1:4，反应温度为55℃。

2.6.3 验证实验

按最佳处方A2B1C3进行验证实验，其复合率 为 102.98%，pH=3时 Papp=0.392，pH=6.8时Papp=0.323，综合得分为95.11分。

表2 正交实验设计及结果

表3 方差分析结果

3 讨论

天然活性成分磷脂复合物是将天然活性成分与磷脂在适宜条件下进行复合得到的一类化合物。据报道，天然活性成分磷脂复合物的理化性质和生物性质较原化合物均有不同程度的改变，具有较强的亲脂性，通过与磷脂复合而形成载体系统或前体药物，可有效地提高天然活性成分的体内吸收，显著地改善其生物有效性[10，11]。

本研究以葛根总黄酮与磷脂复合物复合的百分率以及磷脂复合物的表观油水分配系数为指标，采用正交实验设计，优化了葛根总黄酮磷脂复合物的制备条件，经过工艺筛选，以价格低、来源广甲醇作为反应溶剂，得到了102.98%的复合率，这与文献[12，13]报道的以介电常数大的甲醇、乙醇为反应溶剂时，由于介电常数大所产生的反向电势也大，从而降低了反应物间的相互作用力，不利于异号离子间化合反应的结论相一致。

4 结论

本实验以葛根总黄酮与磷脂复合的百分率以及磷脂复合物的表观油水分配系数为指标，采用正交实验设计，优化了葛根总黄酮磷脂复合物的制备工艺，按得到的优化条件制备的磷脂复合物的复合率 为102.98%。pH=3时，Papp=0.392；pH=6.8时，Papp=0.323，而葛根总黄酮油水分配系数为：pH=3时，Papp=-0.396；pH=6.8时，Papp=-0.657。因此该工艺制备的葛根总黄酮磷脂复合物提高了葛根总黄酮的油水分配系数，改善了脂溶性。

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Research on Preparation Technology of Flavonid Phospholipid Complex of Pueraria

Li Ying,Song Yiqun,Zhang Yun,Zhu Chunyan
(Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Beijing 100193,China)

This study aimed to optimize the preparation technology of phospholipid complex of puerariaflavonoid. Taking composite ratio and oil-water partition coefficient of phospholipid complex as indexes,the single factor test and the orthogonal test were adopted to optimize the formula of the phospholipid complex in pueraria flavonoid. It was found that the optimum conditions were as follows: the weight ratio of pueraria flavonid to soybean phospholipid was 1：4,the reaction solvent was methanol,the concentration of puerariaflavonoid was 4 mg·mL-1,the reaction temperature was 55 ℃ ,and the reaction time was 2 h. The composite ratio of phospholipid complex was 102.98%,with the Papp values of 0.392 (pH=3) and 0.323 (pH=6.8),respectively. The comprehensive score was 95.11. It was concluded that the prescription of phospholipid complex in pueraria flavonoid was desirable featuring high composite ratio,increased oil-water partition coefficient and the improved lipid solubility.

Pueraria flavonoid,phospholipid complex,preparation technology,orthogonal test

10.11842/wst.2016.05.032

R283

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-02-18

修回日期：2016-03-07

＊ 国家自然科学基金委面上项目（81274094）：中药有效部位及其与生物黏附材料相互作用的吸收机制对构建GBDDS的影响，负责人：朱春燕。

＊＊ 通讯作者：朱春燕，研究员，主要研究方向：中药新剂型与新技术。