AQP1、AQP5、AQP8和mRNA在羊水量异常患者中的表达与意义

张雅，石紫云，白润芳

(陕西省人民医院产科，陕西 西安 710038)

AQP1、AQP5、AQP8和mRNA在羊水量异常患者中的表达与意义

张雅，石紫云，白润芳

(陕西省人民医院产科，陕西 西安 710038)

目的 探讨水通道蛋白1(AQP1)、水通道蛋白5(AQP5)、水通道蛋白8(AQP8)与羊水量调节的相关性，以期阐明羊水量异常的分子细胞病理学机制。方法收集我院2012年1月至2015年12月行剖宫产分娩的产妇120例，其中特发性羊水量过少组40例、过多组40例和羊水量正常组40例，采用Western blotting和Q-PCR检测AQP1、AQP5、AQP8蛋白和mRNA的表达，统计分析与其羊水异常的相关性。结果相对于正常组，羊水过少组中AQP1的mRNA表达为下调，但AQP1的蛋白表达却为上调，反之在羊水过多组中AQP1的mRNA为上调，蛋白的表达却为下调，其组间差异具有统计学意义(P＜0.05)；羊水过多组与过少组中AQP5的mRNA表达均为下调，且蛋白表达均为下调，其组间差异具有统计学意义(P＜0.05)；羊水过少组AQP8的mRNA表达均为下调，蛋白表达却为上调，但羊水过多组中AQP8的mRNA为上调，蛋白的表达却为下调，其组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论AQP1和AQP8蛋白的低表达可能会造成羊水吸收减少而导致羊水过多，AQP5蛋白的表达下调可能会引起羊水代谢的异常而导致羊水量异常。

水通道蛋白；mRNA；羊水量；异常；相关性

羊水是保护胎儿的重要成分，羊水的98%是水，其成分主要是来自母体血浆通过胎膜透析羊膜的上皮细胞分泌和胎儿的尿液，另外含有少量无机盐类、有机物荷尔蒙和脱落的胎儿细胞。正常妊娠时羊水的产生与吸收是动态平衡的过程，引起羊水产生或吸收的失衡的任何因素均可造成羊水过多或过少，羊水量异常是产科常见的疾病之一，其发病机制有待阐明，尚无有效的防治措施。近年来由于羊水量异常引起胎儿异常的发病率、死亡率明显升高[1]。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)又名水孔蛋白，是一类位于细胞膜上的蛋白质(内在膜蛋白)，在哺乳动物中至少存在13种(AQP0～AQP12)水通道蛋白家族成员，在细胞膜上组成“孔道”，精细参与调节细胞跨膜的渗透平衡。已有研究报道AQPs在人胎盘及胎膜组织中表达[2-3]，并参与母体与胎儿间的液体交换，且与羊水量的调节相关联[4-5]。本研究通过分别检测水通道蛋白1 (AQP1)、水通道蛋白5(AQP5)、水通道蛋白8(AQP8)在羊水量异常的足月孕妇胎膜中的表达，探讨AQP1、AQP5、AQP8与羊水量调节的相关性，以期阐明羊水量异常的分子病理机制，为寻找羊水量异常的治疗方法有较为深远的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院产科2012年1月至2015年12月收治的行剖宫产分娩的产妇120例，其中特发性羊水量过少、过多和羊水量正常组各40例。所有产妇均为单胎，足月妊娠，无妊娠药物服用史及缩宫素引产史，年龄22～34岁，排除胎膜早破、胎盘异常、胎儿畸形、妊娠期糖尿病、高血压、及其他可能会影响羊水量异常的并发症和合并症。三组研究对象的一般资料比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 通过B超测量分娩前羊水最大暗区垂直深度(AFV)来评估羊水量，AFV≤2 cm为羊水量过少，AFV≥8 cm为羊水量过多。实际羊水量测算方法为：首先是收集羊水和混合液总量，其次是测定混合液中的红细胞压积值(HCT)，再次通过公式计算羊水量。羊水量计算公式为：实际羊水量=羊水和混合液总量-羊水中血量，羊水中血量=羊水和混合液总量×羊水中HCT/产前血HCT×100%。其中羊水量＞2 000 mL为羊水量过多，＜3 00 mL为羊水量过少，3 00 mL≤羊水量≤2 000 mL为羊水量正常[6]。

1.3 研究方法

1.3.1 样本收集 当胎盘娩出后立刻取胎膜组织，剪成大小分别为1 cm×1 cm×1 cm和2 cm×2 cm×1 cm的两份组织，经无菌生理盐水冲洗后迅速保存于-80℃冰箱或液氮中备用。

1.3.2 胎膜组织中AQP1、AQP5、AQP8 mRNA的检测 采用Realtime-PCR检测胎膜组织中AQP1、AQP5、AQP8 mRNA的表达。mRNA的检测盒采用QIAGEN试剂盒，实验操作按使用说明书。实验涉及的引物(见表1)均由生物生工合成。实时荧光定量PCR的条件为：预变性95℃1 min，变性95℃15 s，退火56℃20 s，延伸72℃30 s，共30个循环，最后延伸72℃10 min。Realtime-PCR检测结果均采用相对定量分析方法2-△△Ct法。

1.3.3 胎膜组织中AQP1、AQP5、AQP8蛋白的检测 采用蛋白免疫印记(Western blotting)检测胎膜中AQP1、AQP5、AQP8蛋白的表达。组织蛋白提取采用QIAGEN试剂盒，抗体由Invitrogen公司提供。实验方法均按照说明书操作，首先从胎膜组织中抽提蛋白质并定量；其次经变形聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳，首先将准备好的样品液上样，Marker加进第一个孔后最后一个孔中，然后100 V恒压电泳分离蛋白；再次将蛋白质转移到PVDF膜上，按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，20 mA恒流条件下，4℃转移过夜；然后Western blot膜的封闭和抗体孵育，化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影；最用凝胶图象处理系统分析对胶片进行扫描或拍照后的目标带的分子量和净光密度值。

1.4 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 胎膜组织中AQP1、AQP5、AQP8 mRNA的表达 采用相对定量分析方法2-△△Ct法得出结果，相比于正常组AQP1、AQP5、AQP8 mRNA的相对表达量分别为0.738±0.125、0.784±0.207和0.691±0.115，表达量均下调，且羊水量过少组与正常组比较，其AQP1、AQP5、AQP8 mRNA的相对表达量差异均具有统计学意义(P＜0.05)。反之，羊水量过多组AQP1、AQP8 mRNA的相对表达量分别为2.605、3.017，且与正常组比较，相对表达量均高于正常组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；但羊水量过多组AQP5 mRNA的相对表达量为0.682，相比于正常组其相对表达量下调，并且两者之间差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 胎膜组织中AQP1、AQP5、AQP8 mRNA的相对表达

2.2 胎膜组织中AQP1、AQP5、AQP8蛋白的表达 以GAPDH蛋白表达量为内参进行相对定量分析，羊水量过多组AQP1、AQP5、AQP8蛋白的相对表达量分别为1.638、2.506和1.917，与正常组(4.252、3.992、4.105)比较，表达量均下调，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。反之，羊水量过少组AQP1、AQP8蛋白的相对表达量分别为8.348、7.341，且与正常组比较，相对表达量均高于正常组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；但羊水量过少组AQP5蛋白的相对表达量为1.904，相比于正常组其相对表达量下调，并且两者之间的差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 胎膜组织中AQP1、AQP5、AQP8蛋白的相对表达

3 讨 论

迄今为止，临床上仍有很多不明原因的羊水量异常患者，对羊水量异常的病理机制临床基础研究显示仍未十分清楚，目前也没有很好的预防与治疗措施。近年来随着围产医学的快速发展，羊水量异常引起了国内外医学者的高度重视。众所周知，正常生理代谢情况下，羊水的产生与吸收是动态平衡的过程，当产生与吸收两者任何一个过程发生异常时，都会导致羊水量异常。水通道蛋白是一类膜蛋白，广泛存在与动植物及微生物的膜表面，介导水的跨膜转运并参与调节细胞的渗透平衡，其蛋白发生机能障碍与体内水平衡紊乱性疾病有着密切关系[7]。迄今为止，国内外学者至少已经发现了13中AQP，其中有7种AQP蛋白在人胎膜、胎盘组织中有表达。有学者认为，AQPs参与了母胎之间的液体交换，与羊水量的调节有着密不可分的关系[4]。

AQP1是首个发现的水通道蛋白，有学者指出该蛋白分布在羊膜上皮细胞、胎盘血管内皮细胞等，是羊水膜内吸收的重要调控因素[8]。AQP5目前研究较少，但有研究指出，胚胎肺发育正常中AQP5的基因表达量明显降低，且该蛋白与肺脏的液体代谢关系密切[9]。AQP8蛋白属于水通道蛋白家族中经典的蛋白亚群，对水有着专一的通透性，并有研究指出AQP8在妊娠产妇的羊膜、胎盘等组织中均有表达[10]。因此，本研究通过检测AQP1、AQP5、AQP8在羊水量异常的足月孕妇胎膜中的表达，探讨AQP1、AQP5、AQP8与羊水量调节的相关性。通过我们的研究结果发现，相对于正常组，羊水过少组中AQP1的mRNA表达为下调，但AQP1的蛋白表达却为上调，反之在羊水过多组中AQP1的mRNA为上调，蛋白的表达却为下调。Mann等[11]提出羊水过多的机制可能是胎膜中AQP1蛋白表达减少而引起的羊水膜内吸收减少从而导致羊水过多。但另有研究却指出AQP1的mRNA表达上调不是引起羊水过多的影响因素，而是羊水过多的一种代偿性反应[12]。结合我们的研究结果说明，导致羊水过多的原因是AQP1蛋白的表达下调可能会减少羊水的吸收。本研究结果还显示，羊水过多组与过少组中AQP5的mRNA表达均下调，且蛋白表达均下调。有研究指出胚胎肺发育正常中AQP5的基因表达量明显降低，且该蛋白与肺脏的液体代谢关系密切[9]。由此说明羊水代谢的异常可能是因为AQP5蛋白的表达下调引起，进一步导致羊水量异常。再者本研究还发现，相比于正常组羊水过少组AQP8的mRNA表达均为下调，蛋白表达却为上调，但羊水过多组中AQP8的mRNA为上调，蛋白的表达却为下调。有研究认为AQP8在羊水过多产妇中mRNA和蛋白表发均高于正常组[13]，这与本结果有一定的差异性，其原因可能是样本差异性或检测差异所造成的。从我们的结果可以得出，AQP8蛋白下调可能会造成羊水过多。

综上所述，羊水量异常是导致妊娠不良结局的重要因素之一，严重危害产妇与胎儿的生命健康。为了有效控制羊水量异常的发生，必须找到其发病机理。AQPs蛋白介导水的跨膜转运并参与调节细胞的渗透平衡，其蛋白发生机能障碍与体内水平衡紊乱性疾病有着密切关系。本研究初步证实AQP1和AQP8蛋白的低表达可能会造成羊水吸收减少而导致羊水过多，而导致羊水量异常的另一原因可能是因为AQP5蛋白的表达下调而引起羊水代谢的异常造成的。

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[12]王晓莹,蔡雁.水通道蛋白1和mRNA在羊水量异常的妊娠妇女胎盘及胎膜中的表达[J].中国妇幼保健,2014,29(29):4807-4812.

[13]黄锦,漆洪波.原发性羊水过多产妇胎膜和胎盘组织中水通道蛋白8的表达[J].中华妇产科杂志,2009,44(1):19-22.

Expression and significance of AQP1,AQP5,AQP8 and mRNA in patients with abnormal amniotic fluid volume.

ZHANG Ya,SHI Zi-yun,BAI Run-fang.Department of Obstetrics,the People's Hospital of Shaanxi,Xi'an 710068,Shaanxi, CHINA

ObjectiveTo investigate the correlation between AQP1,AQP5,AQP8 and amniotic fluid volume regulation,in order to further elucidate the molecular mechanism of abnormal amniotic fluid volume.MethodsA total of 120 cases of lying-in woman underwent cesarean section,who admitted to our hospital from January 2012 to December 2015,were selected as the research objects and divided into the oligohydramnios group,polyhydramnios group and normal group,with 40 cases in each group.AQP1,AQP5,AQP8 mRNA and protein expression levels were detected by Western blotting and Q-PCR,and the correlation with abnormal amniotic fluid volume was analyzed.ResultsCompared with the normal group,AQP1 mRNA level in the oligohydramnios group was down-regulated,and AQP1 protein expression was up-regulated,whereas AQP1 mRNA was up-regulated and protein expression was down-regulated in the polyhydramnios group.The differences between the groups were statistically significant(P＜0.05).AQP5 mRNA level and protein expression were down-regulated in the oligohydramnios group,polyhydramnios group,and the difference between the groups was statistically significant(P＜0.05).In the oligohydramnios group,AQP8 mRNA was down-regulated and AQP8 protein expression was up-regulated,whereas in the oligohydramnios group,AQP8 mRNA was up-regulated and AQP8 protein expression was down-regulated.The differences between the groups were statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe low protein expression of AQP1 and AQP8 may result in a reduction of amniotic fluid absorption,resulting in polyhydramnios.The down-regulated protein expression of AQP5 may cause the abnormal amniotic fluid metabolism,resulting in too much or too little amniotic fluid volume.

Aquaporin;mRNA;Amniotic fluid volume;Abnormality;Correlation

R714.46+8

A

1003—6350（2016）19—3115—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.19.006

2016-04-06)

陕西省科学技术基金项目(编号：2015SF131)

石紫云。E-mail：shiziyun1974@163.com