转化生长因子-β1在成年大鼠高氧肺损伤中的表达及重组人促红细胞生成素的影响

刘庆辉　刘　岩　石　敏　俞森洋

(解放军总医院南楼呼吸科，北京　100853)



转化生长因子-β1在成年大鼠高氧肺损伤中的表达及重组人促红细胞生成素的影响

刘庆辉刘岩石敏俞森洋

(解放军总医院南楼呼吸科，北京100853)

〔摘要〕目的探讨TGF-β1在成年大鼠高氧肺损伤中的表达及重组人促红细胞生成素(rHuEPO)的影响。方法健康成年雄性SD大鼠48只，随机分为6组，每组8只。其中5组吸入100%浓度氧气，根据吸氧时间不同分为24 h组、48 h组、72 h组、96 h组，rHuEPO组吸氧时间96 h，在0、24、48、72 h时间点予rHuEPO 1 000 U/kg腹腔内注射，对照组吸入空气，即0 h组。颈动脉采血行动脉血气分析并计算氧合指数。测定血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β水平，肺组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。Western印迹及免疫组化方法检测肺组织转化生长因子(TGF)-β1蛋白表达。结果随暴露于高氧时间的延长，大鼠氧合指数呈逐渐下降趋势，96 h达到最低值。血清中TNF-α、IL-1β水平逐渐增高，48 h达到高峰，此后开始下降。肺组织MDA含量逐渐增高，96 h达到峰值，SOD活性逐渐下降，96 h达到最低值。肺组织中TGF-β1蛋白表达逐渐增多。rHuEPO干预组同96 h组相比氧合指数增加，血清中TNF-α、IL-1β水平下降，肺组织MDA含量下降，SOD活性增高，肺组织中TGF-β1蛋白表达减少。结论rHuEPO通过下调TGF-β1蛋白表达及抗炎、抗氧化作用能够减轻成年大鼠高氧肺损伤。

〔关键词〕高氧；肺损伤；转化生长因子-β1；重组人促红细胞生成素

第一作者：刘庆辉(1971-)男，博士，副主任医师，主要从事急性肺损伤的动物实验研究。

呼吸衰竭的救治中常需要氧疗，但持续高浓度氧疗会导致成年人类似于急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的急性高氧肺损伤(HALI)和新生儿的支气管肺发育不良〔1，2〕。转化生长因子(TGF)-β是一个调节细胞生长和分化的细胞因子超家族，具有参与肺胚胎发育、组织损伤与修复的作用〔3〕，TGF-β1通过多种途径参与了高氧肺损伤的发生、发展过程〔4〕。临床上重组人促红细胞生成素(rHuEPO)广泛用于治疗肾性贫血，并通过提高机体抑制脂质过氧化的能力，具有抗凋亡的活性〔5〕。本研究重点观察了TGF-β1在成年大鼠高氧肺损伤中的动态表达及rHuEPO干预对HALI的影响。

1材料与方法

1.1实验动物健康成年雄性清洁级SD大鼠48只，质量291~315 g。

1.2实验分组将48只大鼠随机分为6组，每组8只。其中5组置入动物实验氧舱(中国烟台东科高压氧设备有限公司)中，吸入100%氧气，根据吸氧时间不同分别为0 h组(吸入空气，即对照组)、24 h组、48 h组、72 h组、96 h组和rHuEPO干预组(吸氧时间为96 h，并分别于0、24、48、72 h腹腔内注射rHuEPO 1 000 U/kg)。

1.3标本采集到达各组实验终点后，将大鼠移出氧舱，10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔内注射麻醉，分离右侧颈总动脉并留取动脉血。取部分肺组织用4%多聚甲醛溶液固定，剩余肺组织置于液氮生物容器保存。肺组织匀浆液制备：每100 mg右肺组织加入0.9 ml PBS(pH 7.4)的比例，冰浴下用组织匀浆器制成10%的肺组织匀浆，3 000 r/min离心20 min，取上清液-20℃冻存。

1.4观察指标通过动脉血氧分压(PaO2)结果计算氧合指数(PaO2/FiO2)。放射免疫方法测定血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β含量。采用相应的试剂盒测定肺组织匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。Western印迹方法检测肺组织转化生长因子(TGF)-β1蛋白表达，测定各蛋白电泳区带的积分灰度值。免疫组织化学法检测肺组织TGF-β1蛋白表达。

1.5统计学分析采用Chiss统计软件进行方差分析。

2结果

2.1氧合指数48 h组(451.36±16.60)同24 h组(453.23±10.50)比较、24 h组同0 h组(452.98±8.10)比较均无统计学差异(P>0.05)。72 h组(368.16±20.66)显著下降，96 h组(123.39±11.46)达最低值。rHuEPO组(321.25±16.93)同96 h组比较显著增高(P<0.01)。

2.2血清TNF-α、IL-1β水平随氧气吸入时间延长，血清TNF-α、IL-1β水平均逐渐增高，48 h达到峰值，此后逐渐下降，但96 h组仍高于正常组。rHuEPO干预组同96 h组比较均有显著下降(P<0.01)。见表1。

表1　六组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平

与0 h组比较：1)P<0.05，与24 h组比较：2)P<0.01，与48 h组比较：3)P<0.01，与72 h组比较：4)P<0.01，与96 h组比较：5)P<0.01

2.3肺组织中MDA、SOD水平随氧气吸入时间的延长，大鼠肺组织中MDA水平逐渐增高，96 h达峰值，rHuEPO干预组较96 h组显著下降；而大鼠肺组织中SOD活性呈逐渐下降，96 h达最低值，rHuEPO干预组较96 h组SOD活性显著增高(P<0.01)。见表2。

表2　六组大鼠肺组织MDA、SOD的水平

与0 h组比较：1)P<0.01，与24 h组比较：2)P<0.01，与48 h组比较：3)P<0.01，与72 h组比较：4)P<0.01，与96 h组比较：5)P<0.01

2.4Western印迹方法检测肺组织TGF-β1蛋白表达随氧气吸入时间延长，大鼠肺组织中TGF-β1蛋白表达逐渐增加，24 h组蛋白电泳区带的积分灰度值(149.93±7.66)较0 h组(109.02±10.74)、72 h组(219.56±9.25)较48 h组(198.21±9.44)显著增高(P<0.01)，96 h组大鼠积分灰度值(244.04±10.72)达到峰值。rHuEPO组积分灰度值(220.03±12.21)较96 h组显著下降(P<0.01)。

2.5免疫组织化学法检测肺组织TGF-β1蛋白表达正常肺组织中TGF-β1有弱阳性表达，广泛分布于肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞及血管周围结缔组织细胞。随氧气吸入时间延长，TGF-β1蛋白阳性细胞数量增多，胞质/膜内棕黄色颗粒也增多，并逐渐出现深棕黄色染色颗粒，甚至棕褐色颗粒，以96 h组大鼠病理改变最为明显。rHuEPO组大鼠肺组织内TGF-β1阳性细胞数量以及胞质/膜内棕黄色颗粒数量均较96 h组大鼠减少。见图1。

图1　各组大鼠肺组织TGF-β1蛋白免疫组化染色(×400)

3讨论

ARDS所致急性呼吸衰竭是一种常见呼吸系统急症，通常需要给予高浓度的氧疗，但持续吸入高浓度氧气可导致机体肺组织结构和功能的异常，即HALI〔1，2〕。高浓度氧持续吸入能直接造成肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的损伤，活性氧种类(ROS)生成增多，巨噬细胞发生应答，TNF-α、IL-1β开始表达，从而活化肺内宿主细胞如内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞，导致趋化因子的产生〔6〕。

本研究选择成年大鼠作为研究对象，置入动物实验专用氧舱中，能够提供稳定可靠的氧浓度，给予持续高氧(100%氧气)吸入，动态观察成年大鼠高氧诱导的急性肺损伤的发生、发展过程，能够更好地模拟成年人氧中毒的肺部损害机制，不同于目前大部分高氧肺损伤局限在幼年或新生动物〔6〕。本研究提示TNF-α、IL-1β参与了高氧肺损伤发生的早期机制，通过作用于其他炎性细胞，进一步活化机体肺部炎症反应而加重肺损伤〔6〕。

MDA是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化而形成的脂质过氧化产物。本研究显示在高氧肺损伤时有大量的脂质过氧化物产生，这种氧化性损害持续存在，氧自由基与肺部脂质发生过氧化反应，并引发脂质过氧化链锁反应，加重肺损伤。SOD是抗氧化酶类，SOD的高低可以间接反映机体清除氧自由基的能力，而雾化吸入胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)通过减轻肺水肿及全身氧化应激反应，能够明显改善大鼠的高氧肺损伤的程度〔7〕。本研究显示高氧暴露后SOD的活性逐渐下降，反映机体抗氧化能力的下降。

TGF-β是一个具有调节细胞生长和分化的细胞因子超家族，具有调节细胞的生长、分化，调节细胞外基质(ECM)的代谢，参与肺胚胎发育、组织损伤与修复的作用〔3〕。TGF-β1通过诱导ROS的生成并导致细胞活性的改变，破坏某些酶的活力，影响细胞膜的功能，造成严重的肺损伤〔4〕。TGF-β1可以趋化单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等，从而促使TNF-α、IL-1等细胞因子合成增加〔8〕。原位杂交技术显示，高氧所致肺组织的异常修复过程在高氧暴露的早期就已出现〔4〕。本研究结果表明：随着大鼠在高氧环境暴露时间的延长，肺组织TGF-β1表达逐渐增加，并于96 h达到高峰，TGF-β1通过上述途径调节高氧肺损伤的多个环节〔4，8〕。

促红细胞生成素(EPO)是肾脏产生的一种30.4 kD的糖蛋白，广泛用于治疗肾性贫血，并对急性肾损伤有一定保护作用〔9〕。近年研究表明EPO可减轻氧化应激相关的脂质过氧化，具有抗凋亡的活性〔10〕，通过抑制多形核白细胞的聚集，减少前炎性因子TNF-α、IL-1β向血液循环中的释放，能够减轻脂多糖及缺血再灌注所致肺损伤〔11，12〕。本研究结果提示，应用rHuEPO预处理后大鼠氧合状况明显改善，血清中细胞因子TNF-α、IL-1β水平显著下降，肺组织MDA含量显著下降，SOD活性显著增高，肺组织TGF-β1表达显著下降。研究结果表明：rHuEPO具有下调大鼠肺组织TGF-β1表达及一定程度的抗炎、抗氧化作用，对高氧所致成年大鼠急性肺损伤具有一定程度的保护作用。

4参考文献

1Bhandari V，Choo-Wing R，Harijith A,etal.Increased hyperoxia-induced lung injury in nitric oxide synthase 2 null mice is mediated via angiopoietin 2〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol，2012;46(5)：668-76.

2Sohn MH，Kang MJ，Matsuura H,etal.The chitinase-like proteins breast regression protein-39 and YKL-40 regulate hyperoxia-induced acute lung injury〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2010;182(7)：918-28.

3Tandon A，Tovey JC，Sharma A,etal.Role of transforming growth factor Beta in corneal function，biology and pathology〔J〕.Curr Mol Med，2010;10(6)：565-78.

4Koli K，Myllarniemi M，Keski-Oja J,etal.Transforming growth factor-beta activation in the lung：focus on fibrosis and reactive oxygen species〔J〕.Antioxid Redox Signal，2008;10(2)：333-42.

5Calo LA，Davis PA，Piccoli A,etal.A role for heme oxygenase-1 in the antioxidant and antiapoptotic effects of erythropoietin：the start of a good news/bad news story〔J〕.Nephron Physiol，2006;103(3)：p107-11.

6Bhandari V，Elias JA.Cytokines in tolerance to hyperoxia-induced injury in the developing and adult lung〔J〕.Free Radic Biol Med，2006;41(1)：4-18.

7Yen CC，Lai YW，Chen HL,etal.Aerosolized human extracellular superoxide dismutase prevents hyperoxia-induced lung injury〔J〕.PLoS One，2011;6(10)：e26870.

8Zhu Y，Culmsee C，Klumpp S,etal.Neuroprotection by transforming growth factor-beta1 involves activation of nuclear factor-kappaB through phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase-extracellular-signal regulated kinase1，2 signaling pathways〔J〕.Neuroscience，2004;123(4)：897-906.

9Moore E，Bellomo R.Erythropoietin (EPO) in acute kidney injury〔J〕.Ann Intensive Care，2011;1(1)：3.

10MacRedmond R，Singhera GK，Dorscheid DR.Erythropoietin inhibits respiratory epithelial cell apoptosis in a model of acute lung injury〔J〕.Eur Respir J，2009;33(6)：1403-14.

11Shang Y，Li X，Prasad PV,etal.Erythropoietin attenuates lung injury in lipopolysaccharide treated rats〔J〕.J Surg Res，2009;155(1)：104-10.

12Tascilar O，Cakmak GK，Tekin IO,etal.Protective effects of erythropoietin against acute lung injury in a rat model of acute necrotizing pancreatitis〔J〕.World J Gastroenterol，2007;13(46)：6172-82.

〔2014-12-10修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

通讯作者：俞森洋(1947-)，男，教授，博士生导师，主要从事老年呼吸衰竭救治、机械通气研究。

基金项目：北京市自然科学基金课题(7082088)

〔中图分类号〕R563

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0572-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.025