大鼠阴茎组织中DDAH1和神经型一氧化氮合酶的变化及其对勃起功能障碍的影响

王建华　岳建华　张　辉　张克勤　姜　斌　傅　强

(山东大学附属省立医院，山东　济南　250021)



大鼠阴茎组织中DDAH1和神经型一氧化氮合酶的变化及其对勃起功能障碍的影响

王建华岳建华1张辉张克勤姜斌傅强

(山东大学附属省立医院，山东济南250021)

〔摘要〕目的探讨老年大鼠阴茎组织中不对称二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(DDAH1)和神经型一氧化氮合酶(nNOS)的变化对老年性勃起功能障碍(ED)的影响。方法随机抽取3月龄与18月龄大鼠作为青年组与老年组，检测两组大鼠基础阴茎海绵体内压(ICP)；电镜观察两组大鼠阴茎海绵体组织细胞形态学差异；采用ELISA方法检测两组大鼠阴茎组织中不对称二甲基精氨酸(ADMA)浓度；采用Western印迹检测大鼠阴茎组织中DDAH1及nNOS表达水平。结果老年组与青年组基础ICP无明显差异(P>0.05)，注射罂粟碱后老年组ICP明显低于青年组ICP(P<0.05)；电镜发现老年组阴茎海绵体组织中内皮下纤维化明显；内皮细胞细胞器减少，线粒体聚集、肿胀明显，细胞核变形、固缩时见。青年组组织内未见明显异常。ELISA发现老年组阴茎海绵体内ADMA浓度明显高于青年组(P<0.01)。Western印迹发现老年组阴茎组织中DDAH1与nNOS的表达明显低于青年组(P<0.05)。结论增龄对阴茎组织中DDAH1和nNOS的影响是引起老年性勃起功能障碍的重要原因。

〔关键词〕增龄；勃起功能障碍；二甲基精氨酸二甲胺水解酶1；神经型一氧化氮合酶；不对称二甲基精氨酸

1沂水中心医院

第一作者：王建华(1988-)，男，在读硕士，主要从事勃起功能障碍相关研究。

目前研究认为老年性勃起功能障碍(ED)主要与阴茎组织内一氧化氮(NO)浓度降低有关〔1〕。NO主要由一氧化氮合酶(NOS)催化产生，其中神经型一氧化氮合酶(nNOS)在NO合成过程中起重要作用〔2〕。而不对称二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH1)的代谢产物可以抑制NOS的活性进而间接影响NO的合成〔3〕。本研究通过检测大鼠阴茎海绵体内压(ICP)和阴茎组织中DDAH1和nNOS的表达，探讨老年ED的发病机制。

1材料与方法

1.1实验动物、试剂及仪器随机抽取18月龄及3月龄清洁级雄性SD大鼠(成都达硕生物科技有限公司提供)各10只，分别作为老年组和青年组。DDAH1抗体(兔IgG，Santa Cruz，美国)、nNOS抗体(兔IgG，Santa Cruz，美国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒，PVDF膜，RIPA，PMSF，ECL发光试剂盒(Millipore，美国)，大鼠睾酮酶联免疫分析试剂盒(Bioswamp，中国)，酶标仪(BIO-TEK，美国)，凝胶成像仪(LAS-4000mini，美国)，透射电镜(JEM JEOL-1200EX，日本)，压力换能器，BL-420V生物机能实验系统。

1.2方法

1.2.1阴茎海绵体内压测定大鼠称重后给予2%戊巴比妥钠1 ml/kg腹腔注射，等待麻醉满意，取仰卧位固定四肢，在下腹正中切开约3 cm纵行切口，分离阴茎及球海绵体肌。游离周围皮肤。取两个六号静脉针，一个充满肝素后与压力换能器相连，另一个连接1 ml装满3 g/ml的罂粟碱的注射器。于阴茎头体交界处平行将两个针头刺入海绵体两侧。用37℃生理盐水浸湿纱布覆盖切口，5 min更换一次纱布，使切口处保持恒温。用BL-420V生物机能试验系统记录每只大鼠的基础ICP，然后注入0.14 ml罂粟碱，记录ICP变化。

1.2.2收集标本大鼠心脏取血2 ml置于离心管中，4℃保存，待血液凝固后1 500 r/min离心15 min，上清液移至新EP管中，放入-80℃冰箱备用。处死大鼠后从阴茎根部取下阴茎组织，各修剪出1 mm×1 mm×1 mm立方体，放入电镜组织固定液中，剩余组织放入-80℃冰箱备用。

1.2.3电镜样品制备组织块先经2%戊二醛固定2 h，1%锇酸固定1 h，PBS漂洗后梯度丙酮脱水，然后Epon812环氧树脂包埋，切片机切片，用醋酸双氧铀-柠檬酸双重染色，透射电镜观察。

1.2.4ELISA检测ADMA将血清依次进行标准品稀释，加样，温育，洗涤，加酶，温育，洗涤，显色，终止，测定(均严格按照试剂盒说明书操作)。

1.2.5Western印迹检测DDAH1、nNOS的表达取约100 mg阴茎海绵体组织于生理盐水中，剪碎洗净后加入PMSF与RIPA比例为1∶100的混合液适量，匀浆器研磨后于冰上静置5 min。离心机内20 000 r/min 4℃离心30 min，将上清吸到新EP管中，BCA法测蛋白浓度，加入上样缓冲液后金属浴变性。配置SDS-PAGE凝胶，吸取40 μg总蛋白，30 V电泳60 min压线后改为100 V电泳约90 min。100 V转膜后牛奶封闭1 h，4℃冰箱内一抗(1∶200)孵育过夜。洗膜后加入二抗室温孵育2 h。再次洗膜，在成像仪中显影，比较各条带灰度值。

1.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件行独立样本t检验。

2结果

2.1ICP测定老年组与青年组基础ICP无明显差异〔(9.84±1.63)vs(10.66±1.66)mmHg,P>0.05〕；注射罂粟碱后两组大鼠ICP均升高，老年组ICP明显低于青年组〔(33.46±5.37)vs (39.71±3.67)mmHg,P<0.05〕。

2.2电镜观察阴茎海绵体组织电镜下可见老年组大鼠阴茎海绵体组织纤维化明显，内皮细胞内细胞器减少，线粒体聚集、空泡化多见，细胞核固缩、核膜变形、异染色质边集时见。见图1。

2.3ADMA测定老年组阴茎海绵体内ADMA浓度为(61.04±4.19)μmol/g，青年组ADMA为(42.85±4.09)μmol/g。

2.4阴茎海绵体组织内DDAH1、nNOS表达Western印迹结果显示老年组大鼠阴茎组织内DDAH1〔(0.90±0.06)vs(1.12±0.17)〕和nNOS〔(0.83±0.08)vs(1.07±0.11)〕的表达明显低于青年组。见图2。

图1　阴茎海绵体组织电镜观察(×20 000)

图2　两组大鼠阴茎组织nNOS、DDAH1表达比较

3讨论

ED是目前最常见的男科疾病之一，其发病率随着年龄的增长逐渐增加。据报道〔4〕，50岁以下ED的发病率不足10%，而60岁以上人群发病率超过20%。研究发现〔5〕ED的发病主要与阴茎组织中NO生成减少有关。NO是一种非肾上腺能非胆碱能的神经递质，在介导阴茎海绵体动脉平滑肌松弛的过程中发挥主要作用〔6〕。NO主要由NOS分解左旋精氨酸生成。nNOS是NOS的一个亚型，对勃起过程的启动发挥主要作用〔7〕。nNOS合成的神经源性NO通过增加海绵体组织内cGMP含量进而通过一系列复杂反应使阴茎迅速达到勃起状态〔8〕。DDAH1主要分布在nNOS表达的区域〔9〕，其底物ADMA是NOS的竞争性抑制剂，可以通过降低NOS的活性减少NO的生成〔3〕。DDAH1是ADMA的分解代谢酶，超过70%的ADMA是由DDAH1分解代谢的〔10〕。因此nNOS和DDAH1两者表达变化均可影响NO的生成，进而影响阴茎发生ED。

研究发现，DDAH1与血管性疾病〔11〕以及血管病变引起的ED〔12〕有密切关系，但其对老年性ED的影响及其机制尚未清楚。本研究通过对比老年大鼠与青年大鼠罂粟碱诱导的ICP发现，老年大鼠ICP明显低于青年组。而这一变化与阴茎海绵体内DDAH1表达呈正相关，因此本研究认为DDAH1可能降低老年大鼠ED。本研究还发现老年大鼠阴茎海绵体内ADMA的浓度升高，ADMA在阴茎组织内积聚，与NOS上的位点结合，竞争性抑制了NOS的活性，最终使NO生成减少。这一结果进一步验证了DDAH1对勃起功能的影响。Sydow等〔13〕研究证明DDAH1转基因小鼠体内ADMA浓度与对照组相比明显下降，进而可以提高NOS活性，增加NO的生成，改善勃起功能障碍。本研究还通过Western印迹方法比较老年大鼠与青年大鼠阴茎组织内nNOS的表达量，发现老年大鼠阴茎组织内nNOS的表达明显降低。nNOS表达降低可直接导致神经源性NO合成减少，使阴茎不能迅速达到勃起状态。Dashwood等〔14〕通过免疫组化等方法证实在人类阴茎海绵体中nNOS表达下降可导致ED的发生，这与本研究的理论相符。

另外，Galiano等〔7〕认为阴茎海绵体组织中的内皮细胞生成NO减少是ED发生的主要原因，而本研究发现海绵体内皮细胞电镜下细胞器减少，线粒体聚集空泡化，细胞核异常等变化可能是ED的形态学病因。因此，本研究认为DDAH1和nNOS表达减少可能是老年性ED发病的主要原因之一。

4参考文献

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13Sydow K，Mondon CE，Schrader J，etal.Dimethylarginine dimethylaminohydrolase overexpression enhances insulin sensitivity〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008；28(4)：692-7.

14Dashwood MR，Crump A，Shi-Wen X，etal.Identification of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in human penis：a potential role of reduced neuronally-derived nitric oxide in erectile dysfunction〔J〕.Curr Pharm Biotechnol，2011；12(9)：1316-21.

〔2014-05-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者：傅强(1968-)，男，博士，硕士生导师，主任医师，主要从事勃起功能障碍相关研究。

基金项目：山东省科技攻关计划(2007GG2N02074)

〔中图分类号〕R698+.1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0553-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.016