ERIC—PCR指纹图谱及电镜技术在纳豆生产菌鉴定中的应用

宋凯凯等

摘要：纳豆是一种传统的日本食品，由纳豆菌在一定温度湿度条件下发酵大豆而来，新鲜纳豆表面金黄色，风味独特营养丰富。纳豆的主要发酵菌为纳豆菌，属芽孢杆菌属，称为纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis var. natto），是好氧的革兰氏阳性菌。利用扫描电子显微镜和ERIC-PCR指纹图谱技术对4株纳豆菌（高桥纳豆、MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭）进行了亲缘关系鉴定。结果显示，MIZKAM无臭与寿纳豆的亲缘关系较近，而高桥纳豆与其他品种亲缘关系较远。

关键词：纳豆菌；形态学；ERIC-PCR；聚类分析；电镜

中图分类号： Q934；Q933文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0300-03

收稿日期：2013-12-12

基金项目：山东省科学技术厅省良种工程项目（编号：2011LZ006）。

作者简介：宋凯凯（1988—），女，山东潍坊人，硕士研究生，主要从事食药用菌分子遗传育种。E-mail：skk1003@126.com。

通信作者：郭立忠，教授，主要从事食药用菌的品种改良。E-mail：glz119@126.com。纳豆（natto）是日本传统大豆发酵食品。纳豆的主要发酵菌为纳豆菌，属芽孢杆菌属，是好氧的革兰氏阳性菌[1]。纳豆菌能分解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质，使发酵产品中富含氨基酸、有机酸、寡聚糖等多种易被人体吸收的成分，还能分泌各种酶和维生素，从而可促进小肠黏膜细胞的增殖，保证小肠功能正常[2-6]。纳豆还能有效预防和辅助治疗心脑血管疾病。纳豆防治心脑血管疾病的药用价值主要源自纳豆激酶[7]。自1987年纳豆中发现强力溶栓激酶——纳豆激酶以来，纳豆引起了全世界的广泛关注[8]。该酶不仅有显著的溶栓作用，还可以激活静脉内皮细胞的纤维蛋白酶原[9-10]。此外，纳豆菌发酵液中含有多达17种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸[11]，因此纳豆具有“超级健康食品”的美誉。然而，由于当今市场纳豆产品种类繁多，都有各自的菌种命名，因此本试验利用扫描电子显微镜和ERIC-PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR）指纹图谱技术[12]对4个纳豆菌生产种进行鉴定分析，旨在鉴定其个体形态的差别及亲缘关系的远近。

1材料与方法

1.1供试菌株

4个纳豆菌株（高桥纳豆、MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM 无臭），由青岛农业大学农业应用真菌研究室提供。

1.2方法

1.2.1单菌落培养 将4种纳豆菌株接种到LB液体培养基（成分为 10 g/L 蛋白胨、5 g/L酵母粉、5 g/L NaCl）中，放入摇床37 ℃、180 r/min条件下过夜培养，将过夜培养的菌液稀释100倍后取50 μL均匀涂布在LB固体培养基（成分为10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、5 g/L NaCl、20 g/L琼脂）上，放入 37 ℃ 恒温箱中过夜培养，分别挑取菌落做四区划线放入 37 ℃ 恒温箱中培养5 h，挑取单菌落接种到LB液体培养基中过夜培养。

1.2.2菌种的形态学分析——制作纳豆菌的电镜样品（1）将浸泡在75%乙醇中的洁净盖玻片取出在酒精灯火焰上烧一下，待盖玻片冷却后将其放到平板培养的菌落上轻压一下粘取菌落；然后用PBS（pH值为7.4，将2.9 g NaH2PO4·2H2O与29 g Na2HPO4·12H2O用去离子水定容到500 mL）处理3次，每次10 min；用戊二醛固定液（配制比例为戊二醛 ∶PBS ∶去离子水体积比1 ∶8 ∶1）固定2 d，中间换1次固定液。（2）固定2 d后用PBS洗3次，每次10 min。（3）分别用30%、50%、70%、90%、100%乙醇洗样品1 h，使其逐步脱水，再用100%乙醇洗样品30 min。（4）用乙醇 ∶叔丁醇=1 ∶1 的混合液洗样品30 min，再用100%叔丁醇洗样品2次，每次30 min，用叔丁醇逐渐将乙醇从样本中替换出来。（5）将样本抽真空，把盖玻片压碎，将有菌的碎片用导电胶粘附到观察台上喷涂导电材料，然后在电子显微镜下观察。

1.2.3细菌基因组DNA的提取（CTAB/NaCl法）（1）将活化好的菌株转接到5 mL LB液体培养基中，培养至饱和状态，取1.5 mL培养物10 000 r/min离心3 min。（2）沉淀物加入600 μL的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬，加入少量溶菌酶，37 ℃温浴30 min，加入30 μL 10%的SDS和3 μL 20 mg/mL 的蛋白酶K，混匀，于37 ℃温浴1 h。（3）加入 100 μL 5 mol/L的NaCl，充分混匀，再加入80 μL CTAB/NaCl溶液，混匀，于65 ℃温浴15 min。（4）加入等体积的三氯甲烷、异戊醇，混匀，12 000 r/min离心10 min，将上清液转到一个新管中，如果难以移出上请，先用牙签去除界面物质。（5）加入等体积的酚、三氯甲烷、异戊醇，混匀，12 000 r/min离心10 min，将上清液转入另一支新管中。（6）加入1倍体积无水乙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，放入-20 ℃冰箱沉淀 30 min，取出后12 000 r/min离心10 min，将沉淀转移到 1 mL 70%乙醇中洗涤。（7）12 000 r/min离心15 min，弃上清，用超净工作台稍加干燥，重溶于50 μL的TE缓冲液。（8）取 2 μL 上述提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4基因组DNA纯度检测用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，如果DNA条带清晰、整齐、明亮且无拖尾，则表明DNA完整性好且纯度较高，可用作PCR反应。

1.2.5ERIC-PCR扩增ERIC-PCR扩增应用的引物ERIC1（5′-ggggTACCTTgCgACTAACAAATATgCT-3′）、ERIC2（5′-TgCTCTAgACTCTATTCCCTACCATCATgTTC-3′）均由上海生工生物工程有限公司合成。ERIC-PCR反应体系为50 μL，由25 μL Dream Taq PCR Master Mix（2×）、2 μL引物ERIC1（20 μmol/L）、2 μL引物ERIC2（20 μmol/L）、3 μL 基因组DNA、18 μL去离子水组成。ERIC-PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，52 ℃退火1 min，65 ℃ 延伸5 min，35个循环；最后65 ℃延伸 16 min，4 ℃ 结束扩增。

2结果与分析

2.1形态学分析

由图1、图2、图3、图4的电镜照片可以看出，MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭的菌体呈单杆状，而高桥纳豆的菌体呈长杆状，因此MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭3个菌株的亲缘关系较近，而高桥纳豆与其他3个菌株的亲缘关系较远。

2.2DNA提取结果

4个纳豆菌株的基因组DNA 0.8%琼脂糖凝胶电泳图谱见图5，图中1～4号泳道分别为高桥纳豆、MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭的DNA条带。从图5可以发现， DNA条带

清晰、整齐、明亮且无拖尾，表明DNA完整性好且纯度较高，可用作PCR反应。

2.3基因组DNA的ERIC-PCR及聚类分析

图6为4个纳豆菌株的ERIC-PCR 1.4%琼脂糖凝胶电泳图谱，图中M泳道为marker，1～4号泳道分别为高桥纳豆、MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭的ERIC-PCR电泳图谱。

使用NTSYS 2.10e软件对4个菌株的相似性进行聚类分析，结果见图7。

由图7可知，当以相似性系数0.64为阈值时，4个菌株聚成2组：第1组为MIZKAM无臭、寿纳豆、 MIZKAM 1， 第2

组为高桥纳豆；当以相似性系数0.75为阈值时，4个菌株聚成3组，MIZKAM无臭和寿纳豆聚为一组，MIZKAM 1和高桥纳豆各为一组。因此MIZKAM无臭与寿纳豆的亲缘关系较近。

3讨论

本试验通过扫描电子显微镜及ERIC-PCR指纹图谱技术对4个纳豆生产菌株进行了亲缘关系鉴定。通过ERIC-PCR指纹图谱的聚类分析与电镜2种技术，最终都得到MIZKAM无臭与寿纳豆的亲缘关系较近，而高桥纳豆则与其他品种亲缘关系较远的结论，同时也证明了这2种技术对纳豆菌种鉴定的准确性与可靠性。

参考文献：

[1]钟青萍，余世望，梁胜媛. 纳豆菌产生抗菌物质的培养条件的优化[J]. 食品研究与开发，2001，22（4）：16-18.

[2]陈丽花，陈有容，齐凤兰. 功能性食品——纳豆的研制[J]. 上海水产大学学报，2001，10（2）：187-189.

[3]Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al. A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto：a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia，1987，43（10）：1110-1111.

[4]Esaki H.，Onozaki H.，Osawa T.Antioxidative activity of fermented soybean products[J]. ACS Sym Ser，1994，546：353-360.

[5]钟青萍，石木标，王斌. 多功能保健食品——纳豆[J]. 食品研究与开发，2003，24（4）：81-83.

[6]Sumi H. Antibacterial activity of bacillus natto-growth inhibition against Escherichia coli O157[J]. Bioindustry，1997，14：47.

[7]奚晓琦，王加启，卜登攀，等. 纳豆芽孢杆菌的分离鉴定及纳豆激酶高产菌株的筛选[J]. 东北农业大学学报，2009，40（11）：69-75.

[8]蒋立文，周传云，黄香华. 纳豆菌的研究现状和应用进展[J]. 中国食物与营养，2007（6）：24-26.

[9]Kumada K. Isolation of Bacillus sbtilis natto which shows high fibrinolytic activity[J]. Igakutu Seibutsug Aku，1993，126（6）：299-303.

[10]平谷一，中西晃一朗，须见洋行. 血栓溶解剂：日本，日本公开特许89180834[P]. 1989-05-20.

[11]陈有容，齐凤兰，陈丽花.纳豆芽孢杆菌发酵液生理功能及活性成分[J]. 食品工业，2003（4）：42-44.

[12]张辉，杨振泉，赵隽，等. 大肠杆菌ERIC-PCR分子分型方法的建立及其初步应用[J]. 江苏农业学报，2010，26（5）：1098-1103.

1.2.5ERIC-PCR扩增ERIC-PCR扩增应用的引物ERIC1（5′-ggggTACCTTgCgACTAACAAATATgCT-3′）、ERIC2（5′-TgCTCTAgACTCTATTCCCTACCATCATgTTC-3′）均由上海生工生物工程有限公司合成。ERIC-PCR反应体系为50 μL，由25 μL Dream Taq PCR Master Mix（2×）、2 μL引物ERIC1（20 μmol/L）、2 μL引物ERIC2（20 μmol/L）、3 μL 基因组DNA、18 μL去离子水组成。ERIC-PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，52 ℃退火1 min，65 ℃ 延伸5 min，35个循环；最后65 ℃延伸 16 min，4 ℃ 结束扩增。

2结果与分析

2.1形态学分析

由图1、图2、图3、图4的电镜照片可以看出，MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭的菌体呈单杆状，而高桥纳豆的菌体呈长杆状，因此MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭3个菌株的亲缘关系较近，而高桥纳豆与其他3个菌株的亲缘关系较远。

2.2DNA提取结果

4个纳豆菌株的基因组DNA 0.8%琼脂糖凝胶电泳图谱见图5，图中1～4号泳道分别为高桥纳豆、MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭的DNA条带。从图5可以发现， DNA条带

清晰、整齐、明亮且无拖尾，表明DNA完整性好且纯度较高，可用作PCR反应。

2.3基因组DNA的ERIC-PCR及聚类分析

图6为4个纳豆菌株的ERIC-PCR 1.4%琼脂糖凝胶电泳图谱，图中M泳道为marker，1～4号泳道分别为高桥纳豆、MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭的ERIC-PCR电泳图谱。

使用NTSYS 2.10e软件对4个菌株的相似性进行聚类分析，结果见图7。

由图7可知，当以相似性系数0.64为阈值时，4个菌株聚成2组：第1组为MIZKAM无臭、寿纳豆、 MIZKAM 1， 第2

组为高桥纳豆；当以相似性系数0.75为阈值时，4个菌株聚成3组，MIZKAM无臭和寿纳豆聚为一组，MIZKAM 1和高桥纳豆各为一组。因此MIZKAM无臭与寿纳豆的亲缘关系较近。

3讨论

本试验通过扫描电子显微镜及ERIC-PCR指纹图谱技术对4个纳豆生产菌株进行了亲缘关系鉴定。通过ERIC-PCR指纹图谱的聚类分析与电镜2种技术，最终都得到MIZKAM无臭与寿纳豆的亲缘关系较近，而高桥纳豆则与其他品种亲缘关系较远的结论，同时也证明了这2种技术对纳豆菌种鉴定的准确性与可靠性。

参考文献：

[1]钟青萍，余世望，梁胜媛. 纳豆菌产生抗菌物质的培养条件的优化[J]. 食品研究与开发，2001，22（4）：16-18.

[2]陈丽花，陈有容，齐凤兰. 功能性食品——纳豆的研制[J]. 上海水产大学学报，2001，10（2）：187-189.

[3]Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al. A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto：a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia，1987，43（10）：1110-1111.

[4]Esaki H.，Onozaki H.，Osawa T.Antioxidative activity of fermented soybean products[J]. ACS Sym Ser，1994，546：353-360.

[5]钟青萍，石木标，王斌. 多功能保健食品——纳豆[J]. 食品研究与开发，2003，24（4）：81-83.

[6]Sumi H. Antibacterial activity of bacillus natto-growth inhibition against Escherichia coli O157[J]. Bioindustry，1997，14：47.

[7]奚晓琦，王加启，卜登攀，等. 纳豆芽孢杆菌的分离鉴定及纳豆激酶高产菌株的筛选[J]. 东北农业大学学报，2009，40（11）：69-75.

[8]蒋立文，周传云，黄香华. 纳豆菌的研究现状和应用进展[J]. 中国食物与营养，2007（6）：24-26.

[9]Kumada K. Isolation of Bacillus sbtilis natto which shows high fibrinolytic activity[J]. Igakutu Seibutsug Aku，1993，126（6）：299-303.

[10]平谷一，中西晃一朗，须见洋行. 血栓溶解剂：日本，日本公开特许89180834[P]. 1989-05-20.

[11]陈有容，齐凤兰，陈丽花.纳豆芽孢杆菌发酵液生理功能及活性成分[J]. 食品工业，2003（4）：42-44.

[12]张辉，杨振泉，赵隽，等. 大肠杆菌ERIC-PCR分子分型方法的建立及其初步应用[J]. 江苏农业学报，2010，26（5）：1098-1103.

1.2.5ERIC-PCR扩增ERIC-PCR扩增应用的引物ERIC1（5′-ggggTACCTTgCgACTAACAAATATgCT-3′）、ERIC2（5′-TgCTCTAgACTCTATTCCCTACCATCATgTTC-3′）均由上海生工生物工程有限公司合成。ERIC-PCR反应体系为50 μL，由25 μL Dream Taq PCR Master Mix（2×）、2 μL引物ERIC1（20 μmol/L）、2 μL引物ERIC2（20 μmol/L）、3 μL 基因组DNA、18 μL去离子水组成。ERIC-PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，52 ℃退火1 min，65 ℃ 延伸5 min，35个循环；最后65 ℃延伸 16 min，4 ℃ 结束扩增。

2结果与分析

2.1形态学分析

由图1、图2、图3、图4的电镜照片可以看出，MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭的菌体呈单杆状，而高桥纳豆的菌体呈长杆状，因此MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭3个菌株的亲缘关系较近，而高桥纳豆与其他3个菌株的亲缘关系较远。

2.2DNA提取结果

4个纳豆菌株的基因组DNA 0.8%琼脂糖凝胶电泳图谱见图5，图中1～4号泳道分别为高桥纳豆、MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭的DNA条带。从图5可以发现， DNA条带

清晰、整齐、明亮且无拖尾，表明DNA完整性好且纯度较高，可用作PCR反应。

2.3基因组DNA的ERIC-PCR及聚类分析

图6为4个纳豆菌株的ERIC-PCR 1.4%琼脂糖凝胶电泳图谱，图中M泳道为marker，1～4号泳道分别为高桥纳豆、MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭的ERIC-PCR电泳图谱。

使用NTSYS 2.10e软件对4个菌株的相似性进行聚类分析，结果见图7。

由图7可知，当以相似性系数0.64为阈值时，4个菌株聚成2组：第1组为MIZKAM无臭、寿纳豆、 MIZKAM 1， 第2

组为高桥纳豆；当以相似性系数0.75为阈值时，4个菌株聚成3组，MIZKAM无臭和寿纳豆聚为一组，MIZKAM 1和高桥纳豆各为一组。因此MIZKAM无臭与寿纳豆的亲缘关系较近。

3讨论

本试验通过扫描电子显微镜及ERIC-PCR指纹图谱技术对4个纳豆生产菌株进行了亲缘关系鉴定。通过ERIC-PCR指纹图谱的聚类分析与电镜2种技术，最终都得到MIZKAM无臭与寿纳豆的亲缘关系较近，而高桥纳豆则与其他品种亲缘关系较远的结论，同时也证明了这2种技术对纳豆菌种鉴定的准确性与可靠性。

参考文献：

[1]钟青萍，余世望，梁胜媛. 纳豆菌产生抗菌物质的培养条件的优化[J]. 食品研究与开发，2001，22（4）：16-18.

[2]陈丽花，陈有容，齐凤兰. 功能性食品——纳豆的研制[J]. 上海水产大学学报，2001，10（2）：187-189.

[3]Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al. A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto：a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia，1987，43（10）：1110-1111.

[4]Esaki H.，Onozaki H.，Osawa T.Antioxidative activity of fermented soybean products[J]. ACS Sym Ser，1994，546：353-360.

[5]钟青萍，石木标，王斌. 多功能保健食品——纳豆[J]. 食品研究与开发，2003，24（4）：81-83.

[6]Sumi H. Antibacterial activity of bacillus natto-growth inhibition against Escherichia coli O157[J]. Bioindustry，1997，14：47.

[7]奚晓琦，王加启，卜登攀，等. 纳豆芽孢杆菌的分离鉴定及纳豆激酶高产菌株的筛选[J]. 东北农业大学学报，2009，40（11）：69-75.

[8]蒋立文，周传云，黄香华. 纳豆菌的研究现状和应用进展[J]. 中国食物与营养，2007（6）：24-26.

[9]Kumada K. Isolation of Bacillus sbtilis natto which shows high fibrinolytic activity[J]. Igakutu Seibutsug Aku，1993，126（6）：299-303.

[10]平谷一，中西晃一朗，须见洋行. 血栓溶解剂：日本，日本公开特许89180834[P]. 1989-05-20.

[11]陈有容，齐凤兰，陈丽花.纳豆芽孢杆菌发酵液生理功能及活性成分[J]. 食品工业，2003（4）：42-44.

[12]张辉，杨振泉，赵隽，等. 大肠杆菌ERIC-PCR分子分型方法的建立及其初步应用[J]. 江苏农业学报，2010，26（5）：1098-1103.