枸芪复肾丸对IgA肾病模型大鼠MMP-9、TIMP-1的影响

邹　迪　张守琳　王银萍　王宏安　崔成姬

(长春中医药大学附属医院肾病科，吉林　长春　130021)



枸芪复肾丸对IgA肾病模型大鼠MMP-9、TIMP-1的影响

邹迪张守琳王银萍王宏安崔成姬

(长春中医药大学附属医院肾病科，吉林长春130021)

〔摘要〕目的探讨枸芪复肾丸治疗IgA肾病的疗效及作用机制。方法72只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、血尿胶囊组、枸芪复肾丸高、中、低剂量组。采用口服BSA和尾静脉注射LPS方法建立IgA肾病大鼠模型。观察给药8 w后大鼠各时相尿红细胞计数、24 h尿蛋白定量(UTP)；肾组织基质金属蛋白酶(MMP)-9、金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-1的含量变化。结果给药后各组大鼠尿红细胞计数及UTP均有所下降，其中枸芪复肾丸中剂量组明显优于血尿胶囊组(P<0.05)；与空白组比，模型组大鼠血清及肾组织中MMP-9含量明显降低，而TIMP-1含量升高，MMP-9/TIMP-1下降(P<0.05)；给药后，治疗组MMP-9含量明显升高，TIMP-1含量明显降低，MMP-9/TIMP-1升高，其中枸芪复肾丸中剂量组优于血尿胶囊组(P<0.05)。结论枸芪复肾丸能降低IgA肾病血尿、蛋白尿。

〔关键词〕枸芪复肾丸；IgA肾病；MMP-9；TIMP-1

第一作者：邹迪(1980-)，女，主治医师，主要从事肾病研究。

IgA肾病是临床常见的原发性肾小球疾病之一，以肾脏病理显示以IgA为主的免疫复合物沉积在肾小球系膜区为特征〔1〕。在我国和全世界范围内的发病率均较高，在亚洲占肾活检发病率的47.2%。有报道称其20年终末期肾病发生率为15%~40%〔2〕。枸芪复肾丸是我院的院内制剂，用于治疗IgA肾病疗效显著，本文就进一步研究该药治疗IgA肾病的疗效作用机制进行研究。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物选择6周龄健康清洁级雄性Wistar大鼠72只，体重160~200 g，由吉林大学白求恩医学院动物实验室提供。

1.1.2实验仪器、试剂及药物荧光显微镜TXM-500C，上海天省仪器有限公司；全自动酶标仪318C，上海昨非实验室设备有限公司；组织破碎机BIO-950，上海般诺生物科技有限公司。基质金属蛋白酶(MMP-9)及金属蛋白酶组织抑制物(TIMP-1)ELISA检测试剂盒，由上海信裕生物科技有限公司提供；牛血清白蛋白、脂多糖，美国sigma公司；荧光素标记兔抗大鼠IgA抗体，北京博奥森生物技术有限公司。血尿胶囊由郑州市协和制药厂生产(国药准字Z20003007)；枸芪复肾丸，长春中医药大学附属医院制剂室〔长卫药制字(96)1413号〕。

1.2实验方法

1.2.1造模方法大鼠购买后先饲养1 w，以适应环境，随机分为空白组、模型组、血尿胶囊组、枸芪复肾丸高、中、低剂量组。1 w后参照陆慧渝等〔3〕报道的方法制备动物模型，于第9周每组各选取2只，取肾组织行光镜检查验证模型是否成功。

1.2.2分组及给药验证模型成功后，给予血尿胶囊对照组每日灌胃血尿胶囊0.547 g/kg；给予枸芪复肾丸高剂量组5.625 g·kg-1·d-1灌胃、中剂量组2.813 g·kg-1·d-1灌胃、低剂量组1.406 g·kg-1·d-1灌胃；空白组及模型组每天仅给予生理盐水灌胃，4 ml/只。共给药8 w。

1.2.3观测指标观察大鼠的一般状态，包括：体重、毛发、排尿的颜色及尿量，分别于第0、4、6、8、10、12、14、16周末，用代谢笼收集24 h尿液，观察尿液颜色，记录尿量、肉眼血尿次数及程度，取部分尿液行24 h尿蛋白测定，应用尿沉渣法检测尿红细胞计数，采用ELISA法分别检测肾组织中MMP-9和TIMP-1含量(详见试剂盒说明)。

1.3统计学方法应用SPSS19.0软件进行分析单因素方差分析和多因素方差分析。

2结果

2.1一般情况实验过程中给予四氯化碳溶液及脂多糖后造模组共死亡5只，后每笼选取2只用于验证模型是否成功。空白组大鼠在整个实验过程中，状态始终良好，无明显异常。造模4 w各组大鼠出现进食和活动减少，毛色晦暗，体重下降、腹泻及尿色变深；给药后各治疗组大鼠一般状况明显好转，体重有所增加。

2.2各组大鼠尿红细胞计数比较与空白组比较，其余各组大鼠6 w后尿红细胞计数开始升高，且差异随应用药物时间的延长逐渐增大；与模型组比较，血尿胶囊组与枸芪复肾丸组尿红细胞均明显减少，组间比较枸芪复肾丸组下降程度更加明显(P<0.05)。见表1。

2.3各组大鼠24 h尿蛋白定量变化的比较与空白组比较，其余各组大鼠6 w后24 h尿蛋白定量开始出现差异，且差异随应用药物时间的延长逐渐增大；与模型组比较，血尿胶囊组与枸芪复肾丸组24 h尿蛋白定量均明显减少，组间比较枸芪复肾丸组下降程度更为明显(P<0.05)。见表2。

2.4各组大鼠的肾组织中MMP-9、TIMP-1含量变化的比较与空白组比较，各组肾组织中MMP-9、TIMP-1有明显变化(P<0.01)。与模型组比较，血尿胶囊组及枸芪复肾丸组大鼠的表达有较明显差异(P<0.05)，组间比较，枸芪复肾丸组改变更加明显(P<0.05)。MMP-9在空白组大鼠及治疗组大鼠中含量较高，而模型组含量较少，TIMP-1在空白组大鼠及治疗组大鼠中含量较低，而模型组含量较高。与空白组比较，各组肾组织中MMP-9/TIMP-1有明显变化(P<0.05)。与模型组比较，枸芪复肾丸组及血尿胶囊组大鼠的表达有较明显差异(P<0.05)，枸芪复肾丸组下降程度更加显著(P<0.05)。见表3。

表1　治疗前后各组大鼠各时相尿红细胞计数的比较±s,n=12)

与空白组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05；与血尿胶囊组比较：4)P<0.05；与枸芪复肾丸中剂量组比较：5)P<0.05，表2同

表2　治疗前后各组大鼠24 h尿蛋白定量的比较

表3　各组大鼠肾组织中MMP-9、TIMP-1含量(pg/ml)及

与空白组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05；与血尿胶囊组比较：3)P<0.05；与枸芪复肾丸中剂量组比较：4)P<0.05

3讨论

现代研究认为：IgA 肾病是多种原因共同作用的结果〔4〕，在IgA肾病发病过程中多种因素可以导致肾小球硬化以及肾小管间质纤维化，最终导致肾衰竭。细胞外基质(ECM)的生成失衡和降解失衡可导致ECM过量积聚，导致肾小球硬化和肾间质纤维化，从而导致肾功能受损。TIMP是调节ECM生成和降解平衡的主要因素之一。MMP-9能够降解ECM的胶原和非胶原成分；同时，MMP还受TIMP1和胞浆原性活性抑制物-1(PAI-1)的抑制。正常情况下ECM在这些因素的调解下处于动态平衡，MMPs/TIMPs失衡是导致ECM降解异常的重要环节。研究表明，MMP-9/TIMP-1的异常表达在肾小球纤维化的进展中起重要作用。在慢性间质纤维化时，则有小管基底膜的增厚和小管间质ECM的扩增，其中小管上皮细胞对上述各因素的影响可能占有重要地位〔5〕。小管上皮细胞对ECM的影响还可以通过调节MMP的活性来实现。高糖引起近曲小管上皮细胞外Ⅳ型胶原(ColⅣ)和纤维连接蛋白(FN)的增加与TIMP1和TIMP2的增加有关〔6〕。试验以证明低氧引起的ECM增加与MMP2活性降低和TIMP1的增加有关。除小管上皮基底膜增厚外，有时可以见到基底膜的断裂，这与ECM被MMP降解有关。因此可推测，MMP-9的含量与IgA模型大鼠的病情呈正相关，TIMP-1的含量与IgA模型大鼠的病情呈负相关。因此，可以通过调节MMP-9/TIMP-1 在肾脏组织中的表达来改善肾小球纤维化的病变程度。

目前研究认为，由IgA肾病引发肾小球源性血尿、蛋白尿大约在10~20年可进展为终末期肾病。因此，积极控制血尿是不容忽视的问题。中医药治疗IgA肾病取得了很好的疗效，已经被大量临床实践证明〔7~10〕。

枸芪复肾丸是我院名老中医的经验方，是根据多年临床经验研制而成，在临床上效果较好，尤其是用于IgA肾病，可显著降低血尿、蛋白尿。方中枸杞子、黄芪为君药，黄芪与枸杞子同用既能补肾健脾有利于长养肾精精髓，同时能利尿祛湿。臣以生地黄、女贞子、旱莲草、二蓟既能助君药清热凉血止血以治标，同时又能补肾养阴以培其本；佐使药为槐花、赤芍、当归、益母草、白茅根、牡丹皮、栀子、大黄，可助君药凉血止血而不留瘀。诸药合用，攻补兼施，共奏补肾健脾以扶正，清热凉血利湿，化瘀通络以祛邪的作用，使血止而不留瘀。

本实验证明MMP-9、TIMP-1的表达与IgA肾病相关。经枸芪复肾丸治疗后，大鼠IgA肾病症状明显改善，肾脏及血清中MMP-9、TIMP-1变化明显改善，揭示了枸芪复肾丸可能通过调节MMP-9、TIMP-1的表达，从而调节MMP-9/TIMP-1，起到治疗作用。

4参考文献

1王海燕.肾脏病学临床概览〔M〕，北京：人民卫生出版社；2008：141-5.

2Barratt J，Feehally J.IgA nephropathy〔J〕.J Am Soc Nephrol，2005;16(7)：2088-97.

3陆慧渝，张巧玲，蒋小云,等.IgA肾病大鼠模型的建立〔J〕.中国误诊学杂志，2011;11(6)：1264-7.

4Wada J，Sngiyama H，Makino H.Pathogenesis of IgA nephropathy〔J〕.Semin Nephrol，2003;23(6)：556-63.

5师锁柱，张雪光，陈香美.MMP-9/IgA和TIMP-1/IgA在IgA肾病患者肾组织中的共表达及意义〔J〕.军医进修学院学报，2011;32(12)：1269-73.

6Lam S，Verhagen NA，Strutz F，etal.Glucose-induced fibronectin and collagen type Ⅲ expression in renal fibroblasts can occur independent of TGF-beta l〔J〕.Kidney Int，2003;63(3)：878-88.

7万启军，石成钢，何永成，等.益肾汤联合强的松与依那普利对IgA肾病小鼠肾MMP-9、TIMP-1表达的影响〔J〕.中山大学学报(医学科学版)，2008;29(4)：412-7.

8王晓星，涂元宝，刘贤亮，等.滋阴活血方治疗IgA肾病阴虚血瘀证60例〔J〕.安徽中医药大学学报，2014；33(4)：38-41.

9陈香美，陈以平，周柱亮，等.肾乐胶囊治疗IgA肾病肺脾气虚证患者的前瞻性多中心随机对照临床研究〔J〕.中国中西医结合杂志，2006；26(12)：1061-5.

10陈香美，陈建，陈以平，等.肾华片治疗IgA肾病(气阴两虚证)多中心随机对照临床观察〔J〕.中国中西医结合杂志，2007；27(2)：101-5.

〔2015-03-27修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者：张守琳(1969-)，女，主任医师，主要从事肾病研究。

基金项目：吉林省科技厅资助项目(20130206071YY；2015101214JC)；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(2014第65号)

〔中图分类号〕R28

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0549-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.014