肌球蛋白调节性轻链磷酸化在心脏疾病中的研究进展

王顺 综述 吴钢 审校

(武汉大学人民医院心内科 武汉大学心血管病研究所 心血管病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060)



肌球蛋白调节性轻链磷酸化在心脏疾病中的研究进展

王顺 综述 吴钢 审校

(武汉大学人民医院心内科 武汉大学心血管病研究所 心血管病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060)

肌球蛋白调节性轻链可通过磷酸化调节心肌收缩、肥大、程序性细胞死亡、纤维化和扭转，从而影响心脏功能。虽然肌球蛋白调节性轻链磷酸化的功能和作用机制并不完全清楚，但磷酸化的异常与心脏疾病具有明显相关性。现就肌球蛋白调节性轻链磷酸化的主要功能、作用机制及其在心脏疾病中的研究进展进行综述，为心脏疾病的研究、治疗奠定基础和提供理论依据。

肌球蛋白调节性轻链；磷酸化；心肌肥厚；程序性细胞死亡；纤维化

肌节是横纹肌的功能单位，由多种蛋白质按照一定的规则排列形成，分为粗肌丝和细肌丝。粗肌丝的主要成分是肌球蛋白及其调节蛋白，包括一对重链，一对轻链和肌球蛋白结合蛋白C，其中轻链含有两条基本轻链(myosin essential light chain,MLC1)和两条调节性轻链(即肌球蛋白调节性轻链,myosin regulatory light chain,MLC2,MYL2)。肌球蛋白头部与肌动蛋白相互交联后出现横桥循环，使肌肉收缩。这一过程由ATP供能，并受Ca2+的调控。目前，肌球蛋白重链异常导致心肌肥厚已经得到共识，而对肌球蛋白轻链，尤其是MYL2，与心脏疾病的关系，认识尚不深刻。已有报道表明MYL2基因突变与肥厚型和扩张型心肌病有密切相关性[1-2]。MYL2表达减少或功能异常可导致心肌肥厚，甚至心力衰竭，其机制也在研究之中。2007和2008年，Seguchi和Chan分别发现了心脏肌球蛋白轻链激酶(cardiac myosin light chain kinase,cMLCK)，并发现cMLCK在MYL2的致病机制中起着重要作用[3-4]。随后，一系列遗传性小鼠模型建立，使MYL2磷酸化调节心肌收缩、肥大、程序性细胞死亡、纤维化和扭转的作用得到初步认识，其在肥厚型心肌病、扩张型心肌病和心力衰竭等心脏疾病发生过程中的重要性也被强化。现就MYL2磷酸化在心脏疾病中的相关作用进行讨论。

1 肌球蛋白调节性轻链的结构及其磷酸化

1.1 肌球蛋白调节性轻链的结构简介

MLC2被发现于1969年，其肽链含有160个氨基酸，相对分子质量约19 kD(≈1.9×104)[5]。MLC2属于F-手型钙结合蛋白超家族中的一员，含有两个钙结合EF-手型模体，与钙调蛋白和肌钙蛋白C具有相关性[6]。人类和小鼠的MLC2分别由MYL2和Myl2基因编码。MLC2主要存在四种亚型：非肌型、平滑肌型、骨骼肌型和心肌型。心肌型又有心房型(MLC2a)和心室型(MLC2v)，这两型的基因具有高度同源性，它们的初级氨基酸序列有56%的一致性和86%的相似性[7]。MLC2v缺失的小鼠在E12.5发生胚胎致死[7]，表明MLC2是心肌发生和成熟过程中必不可少的成分。MLC1和MLC2包绕在肌球蛋白重链的α-螺旋颈域，呈反向平行排列，具有稳定该区域的作用。这种位置分布使MLC1和MLC2与位于肌球蛋白头部的ATP结合位点和肌动蛋白结合位点产生空间相关性，而肌球蛋白头部的ATP结合位点和肌动蛋白结合位点，是横桥循环过程中将ATP的化学能转换成肌丝机械运动的关键部位，它们可能形成一个功能性的蛋白长分子，对横桥动力学和力的发生具有增强作用。与MLC1不同的是，MLC2的肽链N-末端有一个丝氨酸残基,这个残基可被磷酸化，从而引起MLC2的空间构象由压缩形式变为伸展形式[6]。这可能是MYL2实现其功能的重要步骤，而磷酸化异常是其致病的重要机制。

1.2 肌球蛋白调节性轻链磷酸化

MLC2的磷酸化最早发现于兔骨骼肌中，随后在心肌中也被观察到[8-9]。Scruggs等[10]的研究表明，人类心脏MLC2v的磷酸化位点是Ser15，而小鼠为Ser14和Ser15。MLCK最早于兔的骨骼肌中被提取出来，是Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶，广泛分布于平滑肌、心肌、骨骼肌和非肌组织中[11-12]。人类和小鼠心脏MLC2v磷酸化的主要激酶是心脏特异性MLCK(cMLCK)，其编码基因是Mylk3[3-4]。MLC2v的磷酸化及其激酶cMLCK的表达在心脏中呈从心内膜(低磷酸化)到心外膜(高磷酸化)的梯度分布[13]。两项独立研究已证实cMLCK表达缺乏的小鼠心脏表现出MLC2v磷酸化的丧失[13-14]，说明cMLCK是MLC2v发挥功能必不可少的要素。

另外，有研究表明MLC2v能被拉链相互作用蛋白激酶(zipper-interacting protein kinase，ZIPK)磷酸化，而且ZIPK磷酸化心肌MLC2的能力较平滑肌和非肌MLC2强[15]。乳鼠心肌细胞ZIPK经siRNA的作用后表达量下降，同时出现MLC2v磷酸化水平的降低[15]。但是，cMLCK表达缺失可致MLC2v磷酸化消失[13-14]，表明ZIPK对基础MLC2v的磷酸化并无作用。肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)由三个亚单位组成，分别是1型蛋白磷酸酶催化亚基δ同种型(PP1c-δ)，两种肌球蛋白结合调节亚单位同种型之一(MYPT1或MYPT2)和一个功能未明的小亚基[16]。MYPT2和PP1c-δ的基因经腺病毒转染进入乳鼠心肌细胞，可致MLC2v磷酸化水平降低[17]。同时，转基因小鼠过表达MYPT2可促使其与PP1c-δ形成MLCP全酶，从而减少MLC2v的磷酸化和减弱心肌收缩能力[18]。由于可得到的数据较少，ZIPK和MLCP与MLC2v磷酸化之间的关系仍需进一步研究，尤其是MLC2v去磷酸化的途径。

正常生理状态下，MLC2v的磷酸化水平为40%，这一基础磷酸化水平在心肌纤维力发生的动力学和Ca2+敏感性中发挥重要作用[19]。磷酸化的MLC2能加大肌球蛋白横桥的流动性，促使肌球蛋白头部移向细肌丝的肌动蛋白[6]。另外，磷酸化的MLC2使肌球蛋白诱导的弱结合肌球蛋白-肌动蛋白ADP-P态的磷酸基释放增多，从而上调进入肌肉收缩过程中的横桥数量。这使得肌纤维的Ca2+敏感性增强，并通过横桥转变为强结合的力发生态，加快力发生的速度。同时，力发生态的衰减速度减慢[6]。近期研究表明，MLC2v的磷酸化在心肌横桥水平能够增强肌球蛋白杠杆臂刚度和促进肌球蛋白头部移动，降低肌球蛋白动力学和延长横桥占空比，致使肌球蛋白向肌动蛋白结合位点聚集，以维持细肌丝激活，从而微调肌丝对力的Ca2+敏感性[20]。因此，基础MLC2v磷酸化水平的维持可能是其调节心肌收缩的重要机制。

2 肌球蛋白调节性轻链磷酸化降低相关的病理生理状态

2.1 心肌细胞肥大

Ding等[14]通过对异丙肾上腺素诱导cMLCK+/+、cMLCK+/neo和cMLCKneo/neo小鼠心肌肥厚的研究显示，伴随着cMLCK表达量的下降，MLC2v磷酸化程度逐渐降低。同时，小鼠的心脏重量与胫骨长度之比逐渐增高，心肌细胞的横截面积逐渐增大。另外，Warren等[13]对成年Mylk3+/+和Mylk3-/-小鼠进行心室肌细胞分离，分别测量细胞长轴、短轴和表面积，Mylk3-/-小鼠的心肌细胞明显较Mylk3+/+小鼠肥大，并且其心肌收缩和舒张能力较差。这些研究表明，MLC2v磷酸化的失衡可能是导致心肌细胞肥大的重要机制。但MLC2v磷酸化介导心肌细胞肥大的途径目前并不清楚。

2.2 心肌细胞程序性细胞死亡

2005年，Fazal等已经证实MLCK的特异性抑制剂ML-7能够诱导平滑肌细胞程序性细胞死亡。同时观察到，cMLCK在被抑制后，MLC2v的去磷酸化早于caspase激活。另外，细胞经程序性细胞死亡诱导剂刺激之后，短暂的MLC2v磷酸化增高后紧随MLC2v的去磷酸化[21]。异丙肾上腺素诱导心肌肥厚18～22周后，与cMLCK+/+小鼠相比，MLCK+/neo小鼠出现明显的心室肌细胞坏死，但在心房肌中并未出现[14]。胸主动脉缩窄致心肌肥厚3月后，过表达cMLCK的转基因小鼠心肌细胞程序性细胞死亡量显著少于野生型小鼠[13]。这些研究结果表明，MLC2v的去磷酸化并不是心肌细胞程序性细胞死亡的结果，而是原因，MLC2v磷酸化降低可能通过激活caspase诱导心肌细胞程序性细胞死亡。

2.3 心肌纤维化

压力超负荷诱导心肌肥厚3月后，心肌切片Masson染色结果显示，过表达cMLCK的转基因小鼠心肌纤维化面积所占总面积的百分比远小于野生型小鼠[13]。同时，异丙肾上腺素诱导心肌肥厚后，Masson染色表明，cMLCKneo/neo小鼠在18～22周时出现了较cMLCK+/+小鼠明显的心肌纤维化，但心房肌并没有显示出明显的纤维化。奇怪的是，MLCK+/neo小鼠心室肌在相同周龄时并不显示出明显纤维化，而是心肌细胞坏死[14]。目前，有关MLC2v与心肌纤维化的研究甚少。但已有的研究结果确实提示MLC2v磷酸化降低促进心肌纤维化。而心肌纤维化究竟是MLC2v的直接作用，还是间接代偿性反应，仍需进一步研究探明。

2.4 心脏扭转障碍

早期研究表明，磷酸化MLC2v在心脏中的空间梯度分布能够便于心脏扭转[22]。通过对小鼠心室壁分析，cMLCK和MLC2v的磷酸化在心脏中同时呈现出相应的空间梯度分布[13]。基因敲除Mylk3-/-小鼠和敲入突变MLC2v (Ser14/15Ala)小鼠均在心脏成熟的过程中出现心脏扭转障碍，这种扭转障碍与cMLCK和MLC2v磷酸化的空间梯度分布有密切相关性[13-20]。另外，Rajashree等研究显示，MLC2v磷酸化的梯度分布与蛋白磷酸酶1的分布成反比[7]。MLC2v磷酸化的梯度分布可能使肌纤维的空间走向发生改变，同时，整个心脏的肌球蛋白横桥循环动力学出现差动机制，导致心脏负荷分布差异，从而影响心脏扭转。

3 肌球蛋白调节性轻链磷酸化降低与心脏疾病

3.1 肥厚型心肌病

胸主动脉缩窄术后1周，Mylk3+/+小鼠已出现心肌肥厚，伴随发生的是cMLCK和MLC2v磷酸化水平均较假手术Mylk3+/+小鼠降低[13]。异丙肾上腺素诱导心肌肥厚后，cMLCKneo/neo小鼠的MLC2v磷酸化水平降低，表现出较正常cMLCK+/+小鼠明显的心肌肥厚[14]。Poetter等[23]最早报道称MYL2v突变与家族性肥厚型心肌病具有密切相关性。MYL2的Lys104Glu和D166V突变可导致家族性肥厚型心肌病。Lys104Glu突变小鼠在心肌肥厚的过程中，MLC2v磷酸化水平明显低于正常小鼠[1]。另外，D166V突变小鼠的MLC2v磷酸化水平较低，而MLCK诱导的其磷酸化水平升高可减轻突变所致的改变，故认为磷酸化可作为补救机制缓解病情[24]。Kampourakis等[25]的研究也得到了相同的结果。这些数据表明MYL2v磷酸化降低参与肥厚型心肌病的发生。

3.2 扩张型心肌病

Sheikh等[20]通过对敲入突变MLC2v (Ser14/15Ala)小鼠分析发现，伴随着MLC2v磷酸化的消失，小鼠出现心脏扭转和心肌收缩功能障碍，并且表现出扩张型心肌病的症状。与此相似，基因敲除Mylk3-/-小鼠MLC2v磷酸化处于可测水平以下，症状也类似扩张型心肌病[13]。另外，转基因小鼠通过过表达MYPT2可使MLC2v磷酸化水平降低，减弱Ca2+敏感性和左心室心肌收缩力，进一步导致左心室扩大[18]。最近研究显示MYL2v的D94A突变可导致扩张型心肌病，但值得注意的是，该突变并不影响MYL2的磷酸化[2]，MYL2v磷酸化与扩张型心肌病的关系仍需进一步研究。

3.3 心力衰竭

与Mylk3+/+小鼠相比，胸主动脉缩窄术1周后，Mylk3-/-小鼠出现左室缩短率逐渐降低和收缩末容积逐渐增大。术后3月，Mylk3-/-小鼠出现严重的心力衰竭，左室收缩末和舒张末容积均明显增大，心肌收缩和舒张功能紊乱。另外，Mylk3+/+小鼠在术后1～2周，发生心肌功能由代偿向失代偿的转变，而Mylk3-/-小鼠术后并不出现代偿性反应[13]。与动物实验结果一致，在心力衰竭患者中也观察到MYL2磷酸化水平明显的下降[26]。另外，慢性心力衰竭患者MYL2的表达量也出现显著降低，且与心力衰竭程度正相关[27]，这些结果表明MYL2磷酸化降低在心力衰竭的发生中发挥作用，其作用可能是以肥厚型和扩张型心肌病为媒介。

4 展望

基于遗传性小鼠模型的研究结果表明，MLC2v磷酸化在心肌的收缩、肥大、程序性细胞死亡、纤维化和扭转中发挥重要作用。这些研究都与人类研究具有密切的相关性，强调了MYL2磷酸化在人类心脏疾病的发生中发挥着重要作用[28]。同时，在人类心脏疾病中也观察到MYL2磷酸化的改变[26]。另外，小鼠心脏特异性的过表达骨骼肌MLCK或者cMLCK，可通过提高MLC2v磷酸化水平以减轻应力或者压力超负荷诱导的心肌肥厚[13-29]，这些结果提示MYL2磷酸化在治疗心脏疾病中的潜在作用。然而，能否将MYL2磷酸化直接作为治疗目标以减轻心脏疾病，以及用作心脏疾病的早期诊断标志物，仍有待进一步研究。

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Research Progress of Myosin Regulatory Light Chain Phosphorylation in Cardiac Disease

WANG Shun，WU Gang

(DepartmentofCardiology,RenminHospitalofWuhanUniversity,CardiovascularResearchInstitute,WuhanUniversity,HubeiKeyLaboratoryofCardiology,Wuhan430060,Hubei,China)

Myosin regulatory light chain is a 19 kDa protein containing 160 amino acids and belongs to the EF-hand Ca2+binding protein superfamily.Previously studies have shown that myosin regulatory light chain could modulate cardiac muscle contraction，hypertrophy，apoptosis，fibrosis and torsion，which then would affect cardiac function.Although the function and mechanism of the phosphorylation of myosin regulatory light chain is not exactly known，there seems to be a significant correlation between the abnormity of myosin regulatory light chain phosphorylation and cardiac disease.Here the main function and mechanism of myosin regulatory light chain phosphorylation and its research progress in cardiac disease are reviewed，for the sake of laying the foundation and providing a theoretical basis for the research and treatment of cardiac disease.

Myosin regulatory light chain;Phosphorylation;Myocardial hypertrophy;Apoptosis;Fibrosis

国家自然科学基金面上项目(81270305)

王顺(1990—)，在读硕士，主要从事心肌重构及心电生理研究。Email：617027996@qq.com

吴钢(1972—)，副教授，主任医师，博士，主要从事心电生理及心肌重构研究。Email：wugangmd@163.com

R54

A 【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2016.06.012

2016-05-27

2016-07-04