电针百会透曲鬓穴对急性脑出血大鼠蛋白酶激活受体-1表达的影响

王 艳

电针百会透曲鬓穴对急性脑出血大鼠蛋白酶激活受体-1表达的影响

王 艳

目的 探讨电针百会透曲鬓穴对急性脑出血大鼠模型的神经功能缺损及血脑屏障(BBB)通透性的影响及其机制。方法 将SD雄性大鼠随机分为3组：假手术组、模型组、电针组，每组根据6 h、1 d、3 d、7 d不同时间点分为4个亚组。尾状核内注射Ⅶ型胶原酶制作脑出血模型。脑出血术后各时间点进行神经功能缺损评分；通过测量脑组织伊文思蓝(EB)含量来测量BBB通透性；免疫组化和荧光实时定量PCR方法检测蛋白酶激活受体-1(PAR-1)表达变化。结果 电针治疗可显著改善模大鼠在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d各时间点神经功能缺损评分和脑组织EB含量，电针治疗组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；免疫组化及荧光实时定量PCR检测显示脑出血后PAR-1的表达，电针治疗组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 电针百会透曲鬓穴可改善急性脑出血神经功能缺损症状，降低BBB通透性，其作用机制可能与减少出血灶周脑组织PAR-1的表达有关。

脑出血；电针；百会；蛋白酶激活受体-1；血脑屏障

头针(scalp acupuncture，SA)是指利用毫针去穿刺刺激头皮的特定区域，是在传统针灸理论的基础上，结合现代解剖学、神经生理学和全息生物学发展起来的[1]。有相关系统评价表明，SA可以有效改善急性脑出血病人的神经功能缺损症状[2]。其中，百会穴是督脉上最重要的穴位之一，它位于人头顶的最高点，所有的阳经汇集于此。最新磁共振3D重建技术显示，百会穴位于额叶中央前沟前部[3]。针灸百会穴能提神醒脑，滋阴补阳，补肾固涩，祛除内风，促进复苏。因此，针灸百会穴特别适用于治疗脑中风等神经系统疾病，且已有研究表明，百会穴(GV20)是SA治疗急性脑出血非常关键的穴位[4]。

蛋白酶激活受体(protease activated receptors，PARs)，是一种经典的七次跨膜G蛋白偶联受体，有7个疏水的螺旋状跨膜区域，从而形成3个胞外环状结构和3个胞内环状结构。目前已知的PARs有四种：PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4[5]。其中PAR-1、PAR-2、PAR-3由凝血酶激活，PAR-2由胰蛋白酶或胰岛素样蛋白酶激活。其中PAR-1主要分布在神经系统中，以神经元、星型胶质细胞为主[6]。PAR-1被作为第一信号分子凝血酶激活后，启动胞内信号转导发挥作用。有脑出血后早期脑水肿可能是凝血酶激活PAR-1引起神经的轴突、树突和胶质细胞的突起回缩，造成细胞损伤；后期脑水肿主要是由于凝血酶通过激活PAR-1使毛细血管内皮细胞发生收缩，细胞间隙增大，紧密连接开放导致血脑屏障(BBB)破坏，BBB通透性明显增高可使脑水肿明显加重[7]。 因此，本研究旨在探讨电针百会透曲鬓穴治疗急性期脑出血大鼠的疗效及对PAR-1表达的影响，以期为针灸治疗脑出血提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠108只，体重250 g～300 g。采用完全随机的方法分为3组：假手术组、模型组、电针组。除假手术组外，每组依据不同时间点分为4个亚组，即6 h、1 d、3 d、7 d组，每个亚组取12只大鼠。

1.2 脑出血模型的制备 参照Rosenberg方法[8]，将大鼠用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，头顶剪毛，常规消毒，正中切口，骨膜剥离器剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝，以前囱为坐标原点，向右旁开2.9 mm，向后0.2 mm确定注射点坐标，用牙科钻在颅骨表面钻直径为0.8 mm的圆孔，穿透颅骨但不伤及脑组织，用固定在立体定向仪上的5 μL微量注射器(针头直径0.7 mm)沿钻孔进针垂直插入脑组织6 mm，到达尾状核位置，10 min缓慢匀速注入含0.6 U/μL Ⅶ型胶原酶的生理盐水(normal saline，NS)3 μL，留针10 min，然后缓慢出针，用骨蜡封闭颅骨上的钻孔，缝合切口。 假手术组：不注射胶原酶，其余操作同模型组。

1.3 电针治疗方法 参照华兴帮等制定的《实验动物穴位图谱》，定位“百会”和“曲鬓”穴。将大鼠固定于实验架上，在百会穴位处常规消毒，选用30号2.5 cm不锈钢毫针，快速刺入皮下并斜向右下方达曲鬓穴，针刺方法参照《常用动物动物腧穴图谱》标准。将一块生理盐水湿润的纱布绑在大鼠尾巴根部，另一根毫针插在此纱布中。将G6805-2型电针治疗仪正极接百会穴毫针，负极接大鼠尾巴毫针，连续波，频率2 Hz，强度0.2 mA，留针30 min。电针治疗组于造模后6 h开始治疗，每天进行电针治疗1次。模型组只是固定于实验架上30 min，不进行任何治疗。假手术组不进行任何电针处理。

1.4 神经功能缺损评分 各组大鼠造模术后，待大鼠清醒，分别于术后6 h、1 d、3 d、7 d采用Longa五级评分法[9]，进行神经功能缺损评分。术后6 h评分为1分～3分的视为成功模型。具体评分如下，0分：无神经功能缺损症状；1分：提尾时病灶对侧前肢不能完全伸展，为轻度缺损症状；2分：行走时向病灶对侧转圈，为中度缺损症状；3分：行走时向病灶对侧跌倒，为重度缺损症状；4分：无自发性活动，伴意识障碍。

1.5 伊文思蓝(evans blue，EB)测定血脑屏障通透性 在各个时间点处死的前90 min，进行腹腔麻醉大鼠，经股静脉注射2% EB生理盐水溶液(4 mL/kg)，注射成功后可见大鼠眼睛及四肢迅速变蓝，90 min后开胸，分离心包膜，从左心室插管，插管成功后用动脉夹固定，进行生理盐水快速灌注，剪破右心耳，直到右心耳流出清亮的液体后停止灌注，每只模型需200 mL～250 mL生理盐水。迅速断头取脑，将脑组织分成左右两半，称重后分别放入3 mL的甲酰胺溶液中，60 ℃恒温水浴箱中放置24 h，脑组织显现为无色透明状，各管甲酰胺溶液为深浅不同蓝色，取出脑组织后5000r/min离心甲酰胺溶液20 min，取上清液再10000 r/min离心10 min，取上清液用多功能酶标仪在632 nm波长测甲酰胺中EB的OD值，用纯甲酰胺溶液作对照组。计算脑组织中EB含量公式：脑组织中EB含量(μg/g脑湿重)=标准品EB含量(μg/mL)×甲酰胺量(mL)÷脑湿重(g)，其中标准品EB含量(μg/mL)用标准曲线直线回归方程求出。

1.6 PAR-1检测

1.6.1 免疫组化 各组大鼠在出血后不同时间点给予水合氯醛深度麻醉，迅速打开胸腔，经左心室灌注磷酸盐缓冲生理盐水(PBS 0.01 mol/L，pH7.4)50 mL冲洗血管，继之以200 mL磷酸缓冲液(PBS 0.01 mol/L，pH7.4)配制的含4%多聚甲醛固定液灌注固定脑组织，断头取脑，置于中性甲醛溶液中固定。标本经脱水，石蜡包埋，在切片机上连续切片，片厚3 μm，作免疫组化染色。按试剂公司推荐三步法操作。为确保实验结果的真实性和客观性，染色结果判定由专人单盲阅片。PBS代替一抗作空白对照，用已知阳性标本作阳性对照。在用OlympusCH2型显微镜(10×20倍)下，随机取每张脑片6个不重叠视野，计数PAR-1阳性细胞数。

1.6.2 荧光实时定量PCR 采用Trizol一步法从血肿周围脑组织中提取总RNA，行琼脂糖凝胶电泳检测，用紫外分光光度仪检测RNA 纯度。然后取4 μL 总RNA经反转录酶及随机引物等反应物混合配成20 μL体系，42 ℃ 15 min，95 ℃ 2 min 反转录成cDNA，随后进行实时荧光定量RCR 反应，大鼠PAR-1 引物序列：上游引物5′- CTCAGCCTGTGCGGTCCT-3′，下游引物 5′- AAGTAGACTGCCCTGCCCTC-3，扩增片段206 bp；以大鼠β-actin基因为内参照，引物序列为： 上游：5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游5′-CCATACCCAGGAAGGAAGGCT-3′，扩增片段206 bp。实时荧光定量PCR产物利用公司自带的系统软件分析，可观察扩增曲线，并对cDNA的含量进行定量分析，计算样本的△△Ct值。

2 结 果

2.1 大鼠神经功能缺损评分 模型组大鼠神经功能缺损评分6 h即开始升高，1 d达到高峰，随后开始降低，在术后7 d仍高于正常水平。电针治疗组大鼠神经功能缺损评分与模型组呈相同的变化趋势，1 d神经功能缺损评分最高，随后开始降低，7 d稍高于正常水平。模型组与电针治疗组大鼠在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分(±s) 分

2.2 脑出血后大鼠血脑屏障通透性 假手术组、电针治疗组与模型组大鼠相比，术侧脑组织EB含量在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d时间点差异均有统计学意义(P<0.05)；电针治疗组与假手术组EB含量在脑出血后6 h、1 d时间点比较有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠脑组织EB含量(±s) μg/g

2.3 免疫组化检测PAR-1的表达 PAR-1蛋白的表达阳性细胞染色主要在胞膜、胞浆，可清楚分辨胞核的形态。正常大鼠大脑PAR-1蛋白表达轻度阳性，模型组6 h时PAR-1表达强度开始增强，24 h时PAR-1表达进一步增加，3 d时表达亦较为强烈，然后开始下降，7 d时明显下降，向假手术组水平靠近。在6 h、24 h、3 d及7 d各时间点，模型组和电针组的PAR-1阳性细胞数与假手术组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，电针治疗组与假手术组的PAR-1阳性细胞数比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 电针对PAR-1阳性细胞数时间变化趋势的影响(±s)

2.4 荧光实时定量PCR测定PAR-1mRNA的表达变化 PAR-1模型组在6 h表达开始上升，1 d时进一步表达增加，3 d仍处于较高水平随后又下降，7 d时仍高于正常水平。模型组与假手术组比较在各时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)，电针治疗组与模型组比较在各时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 荧光实时定量PCR测定PAR-1mRNA的表达(±s)

3 讨 论

1990年，Rosenberg等[8]第一次采用注入胶原酶方法在SD大鼠身上成功制成脑出血动物模型。胶原酶是一组可以特异降解基底膜和间质胶原成分的金属基质蛋白酶，分Ⅰ型～Ⅷ型，最常使用来制备脑出血动物模型的是Ⅳ型及Ⅶ型胶原酶。RoSenberg模型，利用脑立体定位仪，9 min内向大鼠尾状核内注入2 μL含有0.01～0.1单位Ⅺ型或Ⅶ型胶原酶的生理盐水，注射10 min即可观察到脑出血及水肿的形成。此方法制造的模型很好地模拟了自发性脑实质内出血的发生和血肿的扩大，以及脑水肿的形成[10]。本实验研究中采用胶原酶诱导法制造脑出血大鼠模型，利用脑立体定位仪向模型大鼠脑尾壳核注入Ⅶ型胶原酶。大鼠脑内最大的核团是尾壳核，立体定位非常容易，尾壳核最容易发生自发性脑出血，因此选用尾壳核定位。术后的大鼠都出现了不同程度的神经功能缺损症状，证明动物模型成功。大鼠脑出血模型制作成功后，会出现病灶对侧肢体不同程度偏瘫、无力等神经功能缺损症状。本实验采用经典的Zea Longa五分制评分方法[9]，结果显示：模型组在脑出血后6 h神经功能缺损评分即开始升高，在1 d达到高峰，随后开始下降。电针治疗组与模型组相比差异有统计学意义，说明电针百会透曲鬓穴在脑出血急性期能改善神经功能缺损症状，有明显的治疗效果。

BBB存在于脑组织与血液之间，是由无窗孔的毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞的足突和基底膜组成的复合体，结构复杂。生理情况下，BBB对水分子高度通透，使脑脊液以自由扩散方式与脑、脊髓进行持续交换，维持中枢神经系统内环境稳定和大脑功能的正常行使。伊文思蓝是一种偶氮基荧光染料，作为常用的BBB的示踪剂，分子量为960.81，可以结合血清蛋白，形成蛋白质复合物，在血脑屏障破坏时或通透性增加时，通过间隙渗入到组织。有研究报道[11]，在组织间隙中EB的量与BBB通透性成正比，即BBB破坏越严重组织间隙中EB的量越多。因此，目前已有不少实验研究采用测量脑组织EB含量的方法来了解脑出血后BBB通透性改变的情况，且研究表明，脑组织EB含量在脑出血后明显升高，并在脑出血后1 d达到高峰期[12-14]。 本课题用多功能酶标仪测脑组织中所含EB的OD值，从而算出EB的含量。实验结果显示，脑出血后6 h脑组织EB含量即明显升高，并在脑出血后1 d达到高峰期。电针治疗组与模型组相比在各个时间点差异均有统计学意义，说明电针百会透曲鬓穴在脑出血急性期能降低BBB通透性，减轻BBB损伤。

脑出血后，脑水肿包括血管源性和细胞毒性水肿，新近的研究表明凝血酶在脑出血后脑水肿的发生中起关键的作用，早期脑水肿(出血24 h以内)是由于凝血酶对脑细胞毒性作用，后期(出血24 h以后)则是由于凝血酶造成的血脑屏障破坏，但其形成机制亦尚未完全阐明[15]。在正常情况下，通过凝血酶影响的大多数的细胞功能是由PARs介导的，在病理情况下，细胞外的凝血酶的重要性在于介导脑缺血的、出血的和外伤的损害。凝血酶在脑消除缓慢，其可能有特别地强大的和延长的效应[16]。本研究结果显示，脑出血后PAR-1的表达增加，提示PAR-1的激活可能在脑出血后脑水肿产生和发展过程中起重要作用，从血肿逐渐释放出的凝血酶可能通过不断激活PAR-1而导致脑损伤。而电针组可显著下调PAR-1的表达，表明电针百会透曲鬓穴在脑出血急性期可能通过降低PAR-1的表达，从而发挥保护脑组织的作用。

[1] Liu Z，Guan L，Wang Y，et al.History and mechanism for treatment of intracerebral hemorrhage with scalp acupuncture[J].Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：895032.

[2] Zheng GQ，Zhao ZM，Wang Y，et al.Meta-analysis of scalp acupuncture for acute hypertensive intracerebral hemorrhage[J].Journal of Alternative and Complementary Medicine， 2011，17：293-299.

[3] Shen EY，Chen FJ，Chen YY，et al.Locating the acupoint baihui(GV20) beneath the cerebral cortex with MRI reconstructed 3D neuroimages[J].Evid Based Complement Alternat Med，2011，2011：362494.

[4] Li HQ，Li JH，Liu AJ，et al.GV20-based acupuncture for animal models of acute intracerebral haemorrhage：a preclinical systematic review and meta-analysis[J].Acupunct Med，2014，32(6)：495-502.

[5] Ayala YM，Cantwell AM，Rose T，et al.Molecular mapping of thrombin-receptor interactions[J].Proteins，2001，45(2)：107-116.

[6] Bartha K，Dömötör E，Lanza F，et al.Identification of thrombin receptors in rat brain capillary endothelial cells[J].J Cereb Blood Flow Metab，2000，20(1)：175-182.

[7] Lee KR，Kawai N，Kim S，et al.Mechanisms of edema formation after intracerebral hemorrhage：effects of thrombin on cerebral blood flow，blood-brain barrier permeability，and cell survival in a rat model[J].J Neurosurg，1997，86(2)：272-278.

[8] Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J].Stroke，1990，21(5)：801-807.

[9] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1)：84-91.

[10] Andaluz N，Zuccarello M，Wagner KR.Experimental animal models of intracerebral hemorrhage[J].Neurosurg Clin N Am，2002，13(3)：385-393.

[11] Migliati E，Meurice N，DuBois P，et al．Inhibition of aquaporin-1 and aquaporin-4 water permeability by a derivative of the loop diuretic bumetanide acting at an internal pore-occluding binding site[J]．Mol Pharmacol，2009，76：105-112.

[12] Shi W，Wang Z，Pu J，et al.Changes of blood-brain barrier permeability following intracerebral hemorrhage and the therapeutic effect of minocycline in rats[J].Acta Neurochir Suppl，2011，110(Pt2)：61-67.

[13] Manaenko A，Fathali N，Khatibi NH，et al.Arginine-vasopressin V1α receptor inhibition improves neurologic outcomes following an intracerebral hemorrhagic brain injury[J].Neurochem Int，2011，58(4)：542-548.

[14] Zhou QB，Jin YL，Jia Q，et al.Baicalin attenuates brain edema in a rat model of intracerebral hemorrhage[J].Inflammation，2014，37(1)：107-115.

[15] Xi G，Reiser G，Keep RF.The role of thrombin and thrombin receptors in ischemic，hemorrhagic and traumatic brain injury：deleterious or protective? [J].J Neurochem，2003，84：3-9.

[16] Xi G，Hua Y，Keep RF.Induction of colligin may attenuate brain edema following intracerebral hemorrhage[J].Acta Neurochir，2000，76：501-505.

(本文编辑郭怀印)

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10．3969/j．issn．1672-1349．2016．04．010

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2015-08-12)