麦粒灸对自发性高血压大鼠血压及mTOR蛋白表达的影响

管媛媛，张宏如，张皓然，顾一煌

麦粒灸对自发性高血压大鼠血压及mTOR蛋白表达的影响

管媛媛，张宏如，张皓然，顾一煌

目的 观察麦粒灸对自发性高血压大鼠血压及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达的影响，以对其降压机制作初步探讨。方法 将12周龄的自发性高血压大鼠随机分为模型组、麦粒灸组，另取12周龄SD大鼠设为正常组。干预前测量每只大鼠血压，并记录。各组相同环境饲养。模型组、正常组不施灸，麦粒灸组每天同一时间段取“足三里”“曲池”进行麦粒灸治疗，每穴灸5壮，每日1次，共28 d。末次施灸结束，再测各组大鼠血压变化并记录。取各组大鼠心脏，用Westernblot检测心肌组织mTOR表达水平。结果 12周时，模型组和麦粒灸组血压明显高于正常组(P<0.01)，模型组和麦粒灸组血压差异无统计学意义(P>0.05)。16周时，麦粒灸组血压明显降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。麦粒灸组mTOR蛋白表达明显升高，与模型组和正常组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论 麦粒灸可能通过调控mTOR蛋白的表达，降低自发性高血压大鼠血压。

高血压；麦粒灸；雷帕霉素靶蛋白；足三里；曲池；眩晕

高血压病是常见的心血管疾患之一，近年来，发病率逐步上升，对原发性高血压采用降压药物治疗仍是目前的普遍治疗方法，但有药物副反应多，病人对药物依赖性强等缺点。已有的研究表明，灸法治疗高血压病具有改善临床症状，操作简单方便，不良反应少，有效安全等特点。但艾灸降血压机制尚待深入研究。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是存在于胞浆中的一种丝/苏氨酸蛋白激酶，与细胞的生长、分裂、存活、迁移、自我更新和细胞周期进程等生理过程密切相关，是细胞生长和增殖的关键调控因子。生物医学资料证明，高血压的发病机制与氧化应激密切相关，而mTOR受活性氧调控，根据氧化应激的程度，它可以引起细胞增殖、生长停止、衰老、凋亡或坏死[1]。本研究以自发性高血压大鼠(SHR)为模型，以麦粒灸为干预手段，观察实验前后大鼠血压以及蛋白表达变化，进一步探索艾灸降血压的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 12周龄雄性自发性高血压大鼠20只，同周龄雄性SD大鼠10只。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK(京)2012-0001，合格证编号：11400700098261。所有SHR大鼠随机分为模型组和麦粒灸组各10只。同周龄雄性SD大鼠设为正常组。

1.2 干预方法 各组相同环境饲养。模型组、正常组不施灸，麦粒灸组于每天同一时间段进行艾灸治疗，将40∶1的金艾绒制作成麦粒大小的灸炷，用特制的大鼠固定板固定好大鼠，取大鼠 “曲池”“足三里” 剪毛后进行艾灸，取穴方法参照《实验针灸学》[2]，每穴灸5壮，每日1次，共28 d。

1.3 血压的测定 通过智能无创血压计(NIBP，澳大利亚)；分别于12 周龄和16周龄，在大鼠清醒安静状态下，将大鼠固定于特制的铁丝套中，套上加热器，温度达 37 ℃～40 ℃，加热10 min～15 min，暴露鼠尾动脉于仪器外，连接血压计的套管套于尾动脉末端，无创性测定尾动脉血压。每只测5次，取平均值。本实验以收缩压(systolic bloodpressure，SBP)为观察指标。

1.4 心肌组织mTOR蛋白表达的测定 实验结束后，处死大鼠，分离心脏，迅速置于液氮，后转入-80 ℃待测。大鼠心肌组织总蛋白浓度采用 Bradford法测定。小鼠心肌组织中mTOR蛋白用常规的Westernblot 印迹法测定。 取 70 μg总蛋白加样于预灌制的8%～15%聚丙烯酰胺凝胶中，在100 V条件下进行电泳2 h，然后电转移至聚偏氟乙烯 (PVDF)膜。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，将膜采用AntimTOR蛋白-一抗(美国Abcam公司)孵育过夜。洗膜后接着室温下将膜用二抗孵育2 h，常规洗膜后采用增加化学发光 (ECL)试剂盒显影曝光对特异性蛋白带进行半定量分析。采用β-action蛋白作为内对照。

2 结 果

2.1 各组大鼠血压变化情况 12周时，模型组与麦粒灸组血压均显著高于正常组(P<0.01)，模型组和麦粒灸组血压差异无统计学意义(P>0.05)。16周与12周相比，正常组大鼠血压无明显变化(P>0.05)，模型组血压明显升高(P<0.01)，麦粒灸组明显降低(P<0.01)；16周时，麦粒灸组血压明显低于模型组(P<0.01)。详见表1。

表1 各组大鼠血压变化情况(±s) mmHg

2.2 各组大鼠心肌组织mTOR蛋白表达情况 与正常组相比，模型组心肌组织mTOR蛋白表达量低于正常组，但差异无统计学意义(P>0.05)；麦粒灸组心肌组织mTOR蛋白表达量明显上升[(0.33±0.02)比(1.54±0.31)，P<0.01]。与模型组相比，麦粒灸组心肌组织mTOR蛋白表达量上升[(1.54±0.31)比 (0.06±0.04)，P<0.01]。详见图1。

图1 各组大鼠心肌组织mTOR蛋白表达情况

3 讨 论

高血压病是现代医学疾病名称，根据其临床特点，可将其归属于中医学“眩晕”“头痛”等范畴，其病机为风、火、痰、瘀、虚等所致的气血运行乖戾，临床表现为肝阳上亢，肾精不足，气血亏虚，痰浊中阻等证型[3]。自古医家就善用灸法治疗心血管疾病，如孙思邈在《备急千金方》中记载：“心懊憹微痛，烦逆，灸心俞百壮”。“心痛暴绞急绝欲死，灸神府百壮，在鸠尾正心有忌”。同时现代医学表明，艾灸在防治心脑血管疾病[4]、预防化疗所致的骨髓抑制[5]、抗疲劳以及调整亚健康状态[6]等方面有明显疗效。临床研究表明，艾灸能够明显提高机体总的抗氧化能力，提高过氧化氢酶活性，减少氧自由基(ROS)和丙二醛(MDA)的生成[7]。研究表明，氧化应激是导致心血管结构和功能异常的主要原因之一，与多种心血管疾病的发生发展有密切关系[8]，血管氧化应激的增加已在自发性高血压大鼠和其他多种高血压实验动物模型中得到了证实。艾灸属于一种热刺激，能够诱导应激耐受即能够使机体产生低水平的应激状态，从而增强机体耐受抵抗能力。已有研究证实，适度的热刺激能够增加生命体抗氧化应激能力，延长寿命，也是生命体生存重要的决定因素[9]。此外，艾灸可以激活热休克蛋白(HSP)，如HSP60、HSP70[10]，而HSP70能够减少H2O2诱导的活性氧(ROS)的积累[11]；哺乳动物mTOR是另一种存在于哺乳动物中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过激活下游与代谢应激密切相关的分p70S6K、HIF-1α等，调控生长周期、血管生成、线粒体代谢等多种分子信号，调控细胞生长[12]。研究证明，mTOR受活性氧调控，根据氧化应激的程度，它可以引起细胞增殖、生长停止、衰老、凋亡或坏死[1]，高程度氧化应激将抑制骨髓干细胞mTOR活性，及其下游蛋白p-mTOR、p-p70S6K、p-S6表达[13]。有研究表明，伴随mTOR水平的降低，机体合成HSP(包括HSP70，HSP90和HSP110)的能力也会大幅度降低[14]。目前，国内外艾灸对mTOR通路及其关键分子调控作用的研究鲜有报道，而同为中医外治的针刺疗法已有相关研究：电针能够激活阿尔茨海默氏病大鼠海马区的AMPK，提高磷酸化AMPK水平，减少p-mTOR 及其下游分子p-p70S60K表达，从而改善小鼠的认知功能[15-16]；而另有研究表明，电针也能通过上调mTOR，提高磷酸化mTOR水平，改善血管性痴呆大鼠的学习和记忆能力[17]。本实验结果表明，艾灸可明显提高mTOR蛋白表达。故推测艾灸能通过调控mTOR蛋白，诱导应激耐受，降低血压实现对心血管保护。具体艾灸如何通过对mTOR蛋白的调控诱导应激耐受，有待于进一步研究。因此，可以推测艾灸降血压作用的机制可能与mTOR蛋白表达有关。明确mTOR蛋白及其信号通路在灸法治疗高血压中的作用，可为阐明艾灸降血压的作用机制和寻找特异性治疗靶点提供理论基础和实验依据。

[1] Lu WC，Chen CJ，Hsu HC，et al. The adaptor protein SH2B1beta reduces hydrogen peroxide-induced cell death in PC12 cells and hippocampal neurons[J]. J Mol Signal，2010，5：17.

[2] 李忠仁．实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003：314.

[3] 黎芳，方显明. 中医外治治疗高血压病的机制研究与临床应用进展[J].中西医结合心脑血管病杂志，2005，3(9)：792-794.

[4] Ye X，Zhang H.Influence of moxibustion temperatures on blood lipids， endothelin-1，and nitric oxide in hyperlipidemia patients[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，2013，33(5)：592-596.

[5] Xu H，Jia Y，Chen J，et al. Current advances in meridians and acupoints for moxibustion in patients with chemotherapy-induced myelosuppression[J]. Tumor，2014，34(6)：564-568.

[6] Zhong D，Tang D，Xue L，et al. Effectiveness of moxibustion for exercise-induced fatigue：a systematic review for randomized controlled trials[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine，2014，20：1-11.

[7] Park H，Kim H，Yoo S，et al. Antioxidant effect of indirect moxibustion on healthy subjects：a pilot study[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，2012，32(4)：590-595.

[8] Zhang PY，Xu X，Li XC. Cardiovascular diseases：oxidative damage and antioxidant protection[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2014，18(20)：3091-3096.

[9] Spiró Z，Arslan MA，Somogyvári M，et al. RNA interference links oxidative stress to the inhibition of heat stress adaptation[J]. Antioxidants & Redox Signaling，2012，17(6)：890-901.

[10] Yu J，Peng H，Lin Y，et al. Effect of moxibustion treatment on cell apoptosis and expressions of heat shock protein and second mitochondrial activator of caspase in acute gastric mucosal lesion of rats[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，2013，33(2)：258-261.

[11] Ghiadoni L，Taddei S，Virdis A. Hypertension and endothelial dysfunction：therapeutic approach[J]. Curr Vasc Pharmacol，2012，10(1)：42-60.

[12] Ding X，Du H，Yoder MC，et al.Critical role of the mTOR pathway in development and function of myeloid-derived suppressor cells in lal(-/-) mice[J]. The American Journal of Pathology，2014，184(2)：397-408.

[13] 黄文秋，黄宏，徐祥，等. mTOR及其下游信号通路在骨髓间充质干细胞氧化应激损伤中的变化及作用[J]. 第三军医大学学报，2013，35(2)：114-118.

[14] Chou SD，Prince T，Gong J，et al. mTOR is essential for the proteotoxic stress response，HSF1 activation and heat shock protein synthesis[J]. PLoS One，2012，7(6)：e39679.

[15] Dong W，Guo W，Zheng X，et al. Electroacupuncture improves cognitive deficits associated with AMPK activation in SAMP8 mice[J]. Metabolic Brain Disease，2014，30(3)：777-784.

[16] 国海东，崔国红，朱晶，等. 电针对阿尔茨海默病大鼠mTOR信号通路相关蛋白表达的影响[J]. 中西医结合心脑血管病杂志，2013，11(7)：843-845.

[17] Zhu Y，Zeng Y，Wang X，et al. Effect of electroacupuncture on the expression of mTOR and eIF4E in hippocampus of rats with vascular dementia[J].Neurological Sciences，2013，34(7)：1093-1097.

(本文编辑郭怀印)

Effects of Moxibustion with Seed-sided Moxa Cone on Blood Pressure and the Expression of mTOR Protein in Spontaneously Hypertensive Rats

Guan Yuanyuan，Zhan Hongru，Zhang Haorang，Gu Yihuang

Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210046，Jiangsu，China Corresponding Author:Gu Yihuang

Objective To observe the effects of moxibustion with seed-sided moxa cone on blood pressure in spontaneously hypertensive rats(SHR) and the expression of mammalian target of rapamycin(mTOR) protein，so as to make preliminary discussion on its anti-hypertensive mechanism.Methods Twenty SHR (12 weeks) were randomly divided into model group，and moxibustion group，10 cases in each one.Another 10 Sprague-Dawley(SD) rats (12 weeks) were set as normal group.Another 10 SD rats of 12 weeks with normal hypertension were regard as control group.The blood pressure of all rats were measured and recorded before the experiment.Rats in all group received identical feeding environment.Rats in model group and normal group did not received moxibustion. Rats in the moxibustion group received moxibustion with seed-sized moxa cone at Zusanli Point and Quchi Point at the same time，5 cones at each acupoint，once a day for 28 days.After the final moxibustion，blood pressure of all rats were measured and recorded again.Western blotting method was used to measure the levels of the expression of mTOR protein in cardiac muscle tissue.Results At 12 weeks，the blood pressure in model group and moxibustion group were higher than that in normal group(P<0.01)，and there was no difference between model group and moxibustion group(P>0.05).After 16 weeks，the level of blood pressure were decreased in moxibustion group，which was lower than that in model group(P<0.01).The expression of mTOR protein was obviously increased in moxibustion group，which was higher than that in model group and normal group(P<0.01).Conclusion Moxibustion with seed-sided moxa cone may reduce the blood pressure in spontaneously hypertensive rats by regulate the expression of mTOR protein.

hypertension；moxibustion with seed-sided moxa cone；mTOR protein；Zusanli Point；Quchi Point

国家体育总局健身气功管理中心科研项目(No.QG2014046)；江苏省普通高校研究生实践创新项目(No.SJLX0438)

南京中医药大学(南京 210046)

顾一煌，E-mail：gyh5196411@163.com

R544.1 R255.3

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2016．04．008

1672-1349(2016)04-0361-03

2015-10-08)