雷公藤配伍金钱草抗肺癌增效作用的组成配比及其量效关系

王君明　孙玉宇　张月月　陈玉龙　李晓冰　苗明三　崔　瑛　屈凌波

(河南中医学院呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南　郑州　450046)



雷公藤配伍金钱草抗肺癌增效作用的组成配比及其量效关系

王君明孙玉宇1张月月陈玉龙李晓冰苗明三崔瑛屈凌波2,3

(河南中医学院呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南郑州450046)

摘要〔〕目的考察雷公藤(LGT)配伍金钱草(JQC)体外抗人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增效作用的组成配比及其量效关系。方法将LGT与JQC按照不同质量配比(1/4、1/2、1/1、2/1、4/1)混合后，分别用水和75%乙醇回流提取，制备LGT/JQC饮片不同质量配比的提取物；采用体外MTT法检测LGT-JQC不同配比配伍提取物(200 μg/ml)对人A549细胞增殖抑制的影响，确定LGT-JQC配伍增效作用的最佳组成配比；进一步采用体外MTT法检测最佳组成配比的提取物对人A549细胞增殖抑制作用的量效关系，计算其半数抑制浓度(IC50)。结果LGT-JQC在质量配比2/1～4/1配伍的醇提物(200 μg/ml)具有抑制NSCLC A549细胞增殖的增效作用(P<0.05)，且配比在2/1时增效作用最强(与配比4/1组比较，P<0.01)，而LGT-JQC配伍的水提物(200 μg/ml)在既定配比下均无增效作用(P>0.05)；LGT-JQC配比在2/1(最佳配比)的醇提物，在浓度为50～400 μg/ml范围内对A549细胞的增殖抑制呈现出良好的剂量依赖性关系，其IC50值为249.40 μg/ml。结论LGT-JQC配伍的醇提物对体外人小细胞肺癌A549细胞增殖的抑制具有协同增效作用，二者组成配比应在2/1～4/1，尤以在2/1作用为佳；LGT-JQC配比为2/1的醇提物，在浓度为50～400 μg/mL对A549细胞的增殖抑制具有良好的量效关系。

关键词〔〕雷公藤；金钱草；非小细胞肺癌；组成配比；配伍增效；量效关系

1洛阳理工学院环境工程与化学系2郑州大学化学与分子工程学院

3河南工业大学化学化工学院

第一作者：王君明(1980-)，男，博士，副教授，主要从事中药药性药效机制及新药开发研究。

雷公藤(LGT)为卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)的干燥根，性寒，味苦、辛，归肝、肾经，功效祛风除湿、活血通络、消肿止痛和杀虫解毒，具有广谱抗癌活性，但毒性较大〔1〕，限制了其疗效发挥及应用。中医药理论、配伍应用及现代配伍研究结果均表明，LGT配伍金钱草(JQC)具有减毒增效作用〔2～4〕。本研究旨在考察LGT-JQC配伍对人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞抗癌增效作用的组成配比及其量效关系。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞株A549细胞株由河南中医学院分子生物学实验中心提供。

1.1.2试药5-氟尿嘧啶(5-Fu)：购于上海伊卡生物技术有限公司，纯度≥99%(HPLC)，批号：EK140319。LGT：产地广西，批号121101，经河南中医学院药学院生药学科陈随清教授鉴定为卫矛科植物雷公藤的干燥根。JQC：产地广东，批号130912，经河南中医学院药学院生药学科陈随清教授鉴定为报春花科植物过路黄(Lysimachia christinae Hance)的干燥全草。RPMI1640(Gibco公司)；胎牛血清：HyClone公司；MTT：Amresco公司；DMSO：Amresco公司；胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)含酚红：Solarbio公司。

1.1.3主要仪器酶标仪(BioTek ELx800uv)；Heraeus细胞培养箱(德国Kendro)；倒置显微镜(ZESS)；SG-603生物安全柜(Bake)；Milli-Q Advantage A10型超纯水机(Millipore)；3-18K高速冷冻离心机(Sigma)；TDL-40B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；XK96-B涡流混合器(姜堰市新康医疗器械有限公司)；BS210S型电子天平(北京塞多利斯天平有限公司)；DZF-6020真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；HH6数显恒温水浴锅(上海比朗仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1提取物的制备

1.2.1.1水提物分别取适量饮片的LGT、JQC、LGT-JQC不同质量配比组合物(LGT/JQC=1/4、1/2、1/1、2/1、4/1)，加10倍量水(W/V=1∶10)，浸泡1 h后，回流提取3次，每次2 h，以4 000 r/min离心10 min，合并离心上清液，回收水，减压干燥得干浸膏，称重，见表1。

1.2.1.2醇提物分别取适量饮片的LGT、JQC、LGT-JQC不同质量配比组合物(LGT/JQC=1/4、1/2、1/1、2/1、4/1)，加10倍量75%乙醇(W/V = 1∶10)，浸泡1 h后，回流提取3次，每次2 h，以4 000 r/min离心10 min，合并离心上清液，回收乙醇，减压干燥得干浸膏，称重，得率见表1。

表1　LGT与JQC单提及不同配比合提的水醇提物得率(%)

1.2.2MTT法测定细胞增殖抑制率

1.2.2.1细胞培养细胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃、5% CO2培养箱，每隔48 h更换1次培养基，实验时细胞用消化液(0.02% EDTA)和0.25%胰蛋白酶(以1∶1比例配制)进行消化，接种于96孔板。

1.2.2.2MTT法测定细胞增殖抑制率细胞以1×104/孔接种96孔培养板，于37℃、5% CO2培养箱培养24 h。设对照组(醇提物以0.4%DMSO为对照，水提物以双蒸水为对照)、药物组(水提物用双蒸水溶解；醇提物用DMSO溶解，并使作用于细胞的DMSO终浓度不高于0.4%)，每组3个复孔，继续培养48 h，去除培养上清，每孔加入0.5 mg/ml的MTT 100 μl，继续培养4 h，小心吸去上清，并加入150 μl DMSO溶解紫色沉淀，用酶标仪在波长为570 nm/630 nm，测定光密度D(λ)值。实验重复3次。按下式计算抑制率(Inhibition ratio)(%)= 〔1-D(λ)实验孔/D(λ)对照孔〕× 100%。计算半数抑制浓度(IC50)。

1.3统计学分析采用SPSS11.5软件，多组间比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间两两比较用LSD法。

2结果

2.1LGT与JQC水提物体外抑制与对照组(0.49%)比较，LGT、JQC、LGT-JQC的不同质量配比(LGT/JQC=1/4、1/2、1/1、2/1、4/1)组成的水提物(200 μg/ml)均能显著抑制A549细胞增殖，抑制率分别为8.97%、13.37%、12.76%、12.22%、14.42%、13.04%、12.10%(P<0.05)；与单用药(选择增殖抑制率较高的JQC组作为比较对象)组比较，LGT/JQC各配比对人A549细胞增殖的抑制作用无显著性差异(P>0.05)。

2.2LGT与JQC醇提物体外抑制与对照组(2.46%)比较，LGT、JQC、LGT-JQC的不同质量配比(LGT/JQC=1/4、1/2、1/1、2/1、4/1)组成的醇提物(200 μg/ml)均能显著抑制A549细胞增殖，抑制率分别为27.13%、10.18%、12.02%、17.70%、25.04%、39.70%、33.13%(P<0.05)；与单用药(选择增殖抑制率较高的LGT组作为比较对象)组比较，LGT/JQC在质量配比为1/1时对人A549细胞增殖的抑制作用无显著性差异(P>0.05)。在质量配比为2/1～4/1时对人A549细胞增殖的抑制作用较单用LGT组显著提高(P<0.05)；与配比4/1组比较，LGT/JQC在质量配比为2/1时对人NSCLC A549细胞增殖抑制作用更强(P<0.01)。

2.3JQC与LGT最佳配比的醇提物体外抑制与对照组(2.91%)比较，LGT/JQC在最佳质量配比(LGT/JQC=2/1)组成的醇提物(50,100,200,300,400 μg/ml)及阳性对照药5-Fu(6.5 μg/ml)均能显著抑制人NSCLC A549细胞增殖，抑制率分别为16.38%，24.80%、42.19%、57.29%、62.60%、42.09%(P<0.05)，且LGT/JQC配伍醇提物随着浓度的增加对A549增殖抑制作用增强，其IC50值为249.40 μg/ml。进一步分析显示，LGT/JQC配伍醇提物在浓度为200 μg/ml时对人A549细胞增殖的抑制与阳性药5-Fu的作用相当(P>0.05)，在300 μg/ml和400 μg/ml均比5-Fu对A549细胞的增殖抑制作用强(P<0.01)。

3讨论

NSCLC恶性程度高，生物学特性复杂，且预后差，目前治疗以手术、化疗、放疗为主，但5年生存率不到15%〔5〕。西医治疗在缩小瘤体方面有一定的优势，而中医治疗除具有直接抗肿瘤的作用外，还可以配合放疗和化疗，起到增效减毒的作用，增强患者对放疗和化疗的耐受性，提高生存质量，对某些晚期肺癌无法手术者，可服抗癌中药延长生存期〔6,7〕。因此，从中医药中寻找新的肿瘤防治药物及方式(如联合用药)是近年来研究的热点。

LGT与JQC合用属于中药相杀配伍的范畴〔2〕，其中来自LGT的二萜、三萜类成分和JQC所含的黄酮类、多糖类成分均具有抗肿瘤作用〔8～11〕。然而迄今为止，有关LGT/JQC配伍在抗肿瘤活性上的增效作用尚未见任何研究报道，限制了LGT与JQC配伍的科学合理应用。本研究结果显示，LGT-JQC配伍的醇提物对体外人NSCLC A549细胞增殖的抑制具有协同增效作用，二者组成配比应在2/1～4/1，尤以在2/1作用为佳。提示通过联合JQC用药一方面可以对LGT起到抗肺癌增效作用，另一方面还可起到降低LGT用量从而降低其中毒的风险。此外，LGT-JQC配比为2/1的醇提物，在浓度为50～400 μg/ml对A549细胞的增殖抑制具有良好的量效关系，LGT/JQC配伍醇提物在浓度为200 μg/ml时对人A549细胞增殖的抑制与阳性药5-Fu的作用相当，在300 μg/ml和400 μg/ml均比5-Fu对A549细胞的增殖抑制作用强。本研究将为LGT与JQC联合抗癌尤其在防治NSCLC方面提供实验依据。

参考文献4

1王君明,贾玉梅,崔瑛.基于以雷公藤甲素为主要抗癌活性成分的雷公藤毒性研究进展及对策 〔J〕.时珍国医国药,2012;23(2):1324-6.

2高学敏.普通高等教育“十一五”国家级规划教材《中药学》〔M〕.第2版.北京:中国中医药出版社,2007：37.

3丁中连.金钱草的药用小方 〔J〕.农村百事通,2010;(2):74-5.

4李波.复方雷公藤汤对肾病大鼠减毒增效作用的实验研究 〔D〕.沈阳:辽宁中医药大学,2007.

5Siegel R,Ma J,Zou Z,etal.Cancer statistics,2014 〔J〕.CA Cancer J Clin,2014;64(1):9-29.

6温士旺,张月峰,李勇,等.五味汤联合吉西他滨顺铂对非小细胞肺癌术后辅助化疗的影响 〔J〕.中国实验方剂学杂志,2014;20(16):184-6.

7陈志刚,卢宏达.中西医结合治疗非小细胞肺癌 〔J〕.中国实验方剂学杂志,2013;19(11):322-4.

8Shao H,Ma J,Guo T,etal.Triptolide induces apoptosis of breast cancer cells via a mechanism associated with the Wnt/β-catenin signaling pathway 〔J〕.Exp Ther Med,2014;8(2):505-8.

9Sha M,Ye J,Zhang LX,etal.Celastrol induces apoptosis of gastric cancer cells by miR-21 inhibiting PI3K/Akt-NF-κB signaling pathway 〔J〕.Pharmacology,2014;93(1-2):39-46.

10Zhao P,Mao JM,Zhang SY,etal.Quercetin induces HepG2 cell apoptosis by inhibiting fatty acid biosynthesis 〔J〕.Oncol Lett,2014;8(2):765-9.

11赵武述,张玉琴,赵世萍,等.黄芪脂多糖、金钱草多糖和山茱萸糖促进免疫作用的研究 〔J〕.中日友好医院学报,1989;3(4):194-8.

〔2015-03-19修回〕

(编辑李相军)

Component ratio and dose-effect relationship of Tripterygium wilfordii combined with Lysimachia christina in inhibiting A549 non-small cell lung cancer cells in vitro

WANG Jun-Ming,SUN Yu-Yu,ZHANG Yue-Yue,etal.

Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450046,Henan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the component ratio and dose-effect relationship of Tripterygium wilfordii (LGT) combined with Lysimachia Christina (JQC) in inhibiting A549 non-small-cell lung carcinoma (NSCLC) in vitro,for the first time.MethodsReflux extraction was used to prepare water or 75% ethanol extracts in different mass component ratios (1/4,1/2,1/1,2/1,4/1) of LGT and JQC.MTT assay was used to test the inhibition of cell proliferation and thus to determine the component ratio and dose-effect relationship of LGT combined with JQC in inhibiting NSCLC A549 cells in vitro.Besides,SPSS statistical software was used to calculate the 50% inhibitory concentration (IC50).ResultsEthanol extracts (200 μg/ml) of LGT-JQC in ratio of 2/1 to 4/1 had synergistic effect in inhibiting NSCLC A549 cell proliferation (P<0.05),and the effect of LGT-JQC in the 2/1 ratio was stronger than that of the 4/1 one (P<0.01),while the water extracts (200 μg/ml) of LGT-JQC in each given component ration had no synergistic effect (P>0.05).The ethanol extract of LGT-JQC in the 2/1 ratio at a concentration of 50～400 μg/ml range all inhibited the proliferation of A549 cells and showed a good dose-dependent manner,and its IC50 value was 249.40 μg/ml.ConclusionsThe ethanol extract of LGT-JQC compatibility has synergistic effect on NSCLC A549 cell proliferation in vitro,the mass component ratio should be at 2/1 to 4/1,and in particular the role better in 2/1.The ethanol extract of LGT-JQC in 2/1 ratio at a concentration of 50～400 μg/ml inhibits the proliferation of A549 cells with good dose-effect relationship.

【Key words】Tripterygium wilfordii Hook.f.;Lysimachia christinae Hance;Non-small-cell lung carcinoma;Component ratio;Compatibility synergy effect;Dose-effect relationship

通讯作者：屈凌波(1963-)，男，博士，博士生导师，教授，主要从事药物化学分析及中药活性成分作用机制研究。

基金项目：国家自然科学 (81473368)；国家自然科学基金青年科学 (81503269)；中国博士后科学基金(2012M521412)；河南中医学院省属科研业务专项(2014KYYWF-QN01)；河南中医学院科技创新团队(2011XCXTD01)

中图分类号〔〕R73〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0014-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.006