术前调强放疗对四肢软组织肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

周　洋， 谢鹏鸣， 许素玲， 周　梅， 白靖平

(新疆医科大学附属肿瘤医院1骨与软组织科，2放疗中心，3病理科, 乌鲁木齐　830011)

术前调强放疗对四肢软组织肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

周洋1， 谢鹏鸣1， 许素玲2， 周梅3， 白靖平1

(新疆医科大学附属肿瘤医院1骨与软组织科，2放疗中心，3病理科, 乌鲁木齐830011)

摘要：目的探讨术前调强放射治疗(IMRT)对四肢软组织肉瘤细胞增殖与凋亡的影响。方法选取新疆医科大学附属肿瘤医院骨与软组织科2012年1月-2013年12月术前IMRT+手术的软组织肉瘤患者23例。收集每例患者的活检及手术后石蜡组织块，自身IMRT前、后对照。采用免疫组织化学染色检测Ki-67的表达，用增殖指数(PI)表示；应用TUNEL法测定肿瘤细胞凋亡，用凋亡指数(AI)表示。比较IMRT前、后及不同临床分期对PI、AI和AI/PI的影响。结果IMRT后PI明显低于IMRT前(P<0.05)；IMRT后AI明显高于IMRT前(P<0.05)；IMRT后AI/PI明显高于IMRT前(P<0.05)；IMRT前Ⅲ期患者的PI和AI明显高于Ⅱb期，IMRT后Ⅲ期患者的PI低于Ⅱb期，AI高于Ⅱb期，差异均有统计学意义(P均<0.05)；调强放疗后Ⅱb期和Ⅲ期的AI/PI与调强放疗前比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，但IMRT前和IMRT后不同临床分期AI/PI比较差异无统计学意义。结论IMRT可以诱导软组织肉瘤细胞的凋亡，抑制软组织肉瘤细胞的增殖。AI/PI在IMRT前、后的变化可以评价术前放疗的疗效。

关键词：调强放疗; 软组织肉瘤; 增殖指数; 凋亡指数; Ki-67

目前临床上四肢软组织肉瘤(STS)的主要治疗手段为手术治疗，随着治疗理念和外科技术的不断进步，保肢手术的适应证逐渐放宽。由于辅助治疗技术的发展，使得局部晚期的STS患者经过辅助放化疗的干预，保肢率有较大提高。研究发现，术前放疗在软组织肉瘤的治疗中的疗效已得到肯定，术后伤口并发症发生率高[1-3]。有关精确放疗在STS中的应用报道较少。本研究采用调强放疗(IMRT)技术对四肢STS患者进行术前放疗，检测IMRT前、后STS组织Ki-67的表达(PI，增殖指数)和凋亡情况(AI，凋亡指数)，旨在探讨术前IMRT对软组织肉瘤细胞增殖和凋亡的影响，为软组织肉瘤IMRT更进一步的基础研究、术前IMRT疗效判定和疾病预后的评估提供客观依据。

1材料与方法

1.1一般资料选择新疆医科大学附属肿瘤医院骨与软组织科2012年1月-2013年12月收治的局部晚期四肢STS患者23例。纳入标准：(1)病理诊断明确为四肢软组织肉瘤的初治患者；(2)美国癌症分期联合委员会(AJCC)软组织肉瘤分期为Ⅱb～Ⅲ期者；(3)影像学评估无安全外科边界(毗邻重要血管、神经及骨骼等组织，局部晚期)者；(4)无放疗禁忌证；(5)自愿接受术前放疗者。排除合并严重慢性疾病、其他恶性肿瘤、依从性差、既往有放疗史及放疗区域皮肤异常的患者。23例局部晚期四肢STS患者术前IMRT后均行肿瘤R0切除。其中男性13例，女性10例，中位年龄34.5岁；原发部位：小腿5例，大腿7例，上臂6例，肩胛区1例，踝关节区1例，膝关节区1例，臀部2例；AJCC临床分期：Ⅱb期11例，Ⅲ期12例；病理类型：滑膜肉瘤5例，尤文氏肉瘤3例，多形性肉瘤(恶性纤维组织细胞瘤)2例，原始神经外胚层肿瘤(PNET)2例，上皮样肉瘤2例，恶性神经鞘瘤2例，纤维肉瘤4例，脂肪肉瘤3例。收集23例患者IMRT前穿刺活检肿瘤石蜡组织块和IMRT后手术大体标本肿瘤石蜡组织块，进行自身IMRT前、后对照。

1.2主要试剂即用型鼠抗人Ki-67单克隆抗体(ZM-0165)、PV超敏试剂盒、DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3方法每个蜡块连续切片4张，厚度4 μm，采用免疫组织化学(PV二步法)检测Ki-67的表达，应用TUNEL法检测原位细胞凋亡，免疫组化阴性对照由PBS代替一抗，原位细胞凋亡检测阴性对照用PBS代替标记液，以试剂公司提供的阳性对照片作为阳性对照。

1.4结果判定

1.4.1免疫组化法检测Ki-67的表达Ki-67阳性表达可见肿瘤细胞核有棕黄色颗粒，随机计数10个高倍(40×10倍)视野，每个视野连续计数100个细胞的阳性细胞数，其平均数记为Ki-67增殖指数(Proliferation index，PI)[4]。

1.4.2TUNEL法检测原位细胞凋亡凋亡细胞：荧光显微镜下细胞核中有黄绿色颗粒者；普通显微镜下细胞核中有棕黄色颗粒者。随机计数10个高倍(40×10倍)视野，每个视野连续计数100个细胞的阳性细胞数，其平均数记为凋亡指数(Apoptosis index，AI)[5]。

1.5统计学处理采用SPSS18.0软件包进行数据处理，所测计量资料数据以均数±标准差(-x±s)表示，采用配对资料的符号秩和检验比较IMRT前、后的差异，采用t检验进行均数的比较，检验水准α=0.05。

2结果

2.1调强放疗前、后PI、AI和AI/PI的比较调强放疗后的Ki-67蛋白阳性细胞数少于调强放疗前(图1A、1B)；调强放疗前PI为(63.02±17.93)，调强放疗后PI为(36.56±18.47)，调强放疗后PI明显低于调强放疗前，差异有统计学意义(Z=-3.361，P=0.001)。调强放疗后凋亡细胞数量高于调强放疗前(图2A～2D)；调强放疗前AI为(24.25±6.34)，调强放疗后AI为(35.07±13.71)，调强放疗后AI明显高于调强放疗前，差异有统计学意义(Z=-2.840，P=0.005)。调强放疗前AI/PI为(0.433±0.205)，调强放疗后AI/PI为(1.262±0.779)，调强放疗后AI/PI明显高于调强放疗前，差异有统计学意义(Z=-3.367，P=0.005)。

2.2临床分期对调强放疗前后PI、AI和AI/PI的影响调强放疗前Ⅲ期患者的PI和AI明显高于Ⅱb期，调强放疗后Ⅲ期患者的PI低于Ⅱb期患者，AI高于Ⅱb期患者，差异均有统计学意义(P均<0.05)；调强放疗后Ⅱb期和Ⅲ期的AI/PI与调强放疗前比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，但IMRT前和IMRT后不同临床分期AI/PI比较差异无统计学意义，见表1。

图1AIMRT前Ki-67蛋白的表达(IHC×400)

图1B IMRT 后Ki-67 蛋白的表达(IHC×400)

图2AIMRT前(TUNEL法 光镜×400)

图2BIMRT后(TUNEL法 光镜×400)

图2CIMRT前(TUNEL法 荧光显微镜×400)

图2DIMRT后(TUNEL法 荧光显微镜×400)

表1　不同临床分期IMRT前、后PI、AI和AI/PI的比较(-x±s)

注：与Ⅱb期比较，*P<0.05；与IMRT前比较，△P<0.05。

3讨论

软组织肉瘤是起源于间叶组织、发生在骨骼肌等软组织的一类原发性恶性肿瘤。传统治疗方式多为截肢或局部切除。尽管截肢能获得较好的局部控制,但手术后生活质量明显下降。因肿瘤紧邻血管神经束，为了保留患肢功能，局部切除后常无法保证切缘阴性或小切缘，故单纯局部切除因受局部解剖因素的限制，难以达到广泛切除的边界，复发率高。软组织肉瘤的复发率高与切缘阳性率高直接相关[6-7]。

术前放疗用于保肢手术的辅助治疗效果已得到肯定[8]。术前放疗还可以杀灭“反应区”内的“卫星灶”，减少手术操作可能造成的肿瘤播散或种植，在提高保肢率的同时可取得较高的局部控制率。目前关于软组织肉瘤术前放疗多为常规放疗，疗程长，放疗后纤维化及术后切口并发症发生率高。本研究将IMRT技术用于软组织肉瘤术前放疗，可降低术前放疗的毒性反应，同时保证疗效。

Ki-67能可靠地反映细胞的增殖活性，有利于恶性肿瘤治疗方法的选择和治疗效果的评估。Ki-67表达越高，肿瘤对放射线照射越敏感[9]。以Ki-67表达变化来评估新辅助放疗对肿瘤细胞增殖的影响，在其他肿瘤的研究中已有相关报道。Andrade等[10]报道新辅助放化疗后，直肠癌组织中以Ki-67标记的肿瘤增殖指数明显下降下降。Hafeez等[11]研究表明Ki-67的表达是早期乳腺癌患者保乳术后的预后因素之一，治疗后Ki-67表达越高，预后越差，反之，预后越好。

软组织肉瘤病理分级对临床分期影响较大，Ⅱb期与Ⅲ期病理分级分别为G2和G3，其余分期指标基本一致。本研究表明，尤文氏肉瘤、滑膜肉瘤及多形性肉瘤(Ⅲ期)等的Ki-67表达较高，增殖指数越高，放射敏感性好，疗效好；相反，脂肪肉瘤、纤维肉瘤及恶性神经鞘瘤(Ⅱb期)等的Ki-67表达相对较低，增殖指数较低，这与软组织肉瘤生物学行为相符。本组患者IMRT后Ki-67的表达(增殖指数)较IMRT前明显下降(P<0.05)，Ⅱb期和Ⅲ期患者在IMRT前、后增殖指数的差异有统计学意义(P<0.05)，说明术前IMRT能降低软组织肉瘤细胞增殖活性，抑制肿瘤细胞的生长。Ki-67标记的增殖指数能较好地反映术前IMRT的敏感性，术前IMRT后增殖指数的降低可能提示软组织肉瘤患者较好的预后。

细胞凋亡是有别于细胞坏死的一种细胞死亡形式，是一种程序化过程。近年来的研究表明，细胞凋亡与肿瘤的发生、发展、疗效及预后密切相关，已成为肿瘤研究的热点[12]。放射线可以诱导细胞凋亡[13]，达到控制或消灭肿瘤的目的，放疗后如果肿瘤组织凋亡指数(AI) 明显上调，说明肿瘤细胞对放疗敏感，疗效及预后相对较好。

刘福坤等[14]研究术前辅助放疗对直肠癌细胞增殖和凋亡的影响，结果显示：新辅助放疗后直肠癌细胞的凋亡指数高于治疗前，差异有统计学意义，提出放疗主要通过促进癌细胞凋亡产生治疗作用。

本研究结果显示：恶性程度较高的软组织肉瘤，如尤文氏肉瘤、滑膜肉瘤和多形性肉瘤等Ⅲ期患者经术前IMRT后，肿瘤细胞凋亡指数较治疗前明显升高(P<0.05)；脂肪肉瘤、纤维肉瘤和恶性神经鞘瘤等Ⅱb期患者IMRT后凋亡指数也有增高，差异也有统计学意义(P<0.05)，但变化程度不如尤文氏肉瘤等显著，这与此类肿瘤对放射线敏感程度较高有关。本研究结果显示：IMRT后凋亡指数较治疗前明显升高，说明IMRT可不同程度地诱导软组织肉瘤细胞的凋亡，从而可以通过治疗前、后的凋亡情况评价软组织肉瘤新辅助放疗的疗效。

肿瘤细胞的增殖与凋亡是评价治疗敏感程度和疾病预后的重要指标。放射线是通过诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖来清除肿瘤细胞，因此术前IMRT疗效应以凋亡和增殖的综合因素评价。本研究采用AI/PI作为判定术前IMRT疗效的指标，结果显示IMRT前和IMRT后不同临床分期AI/PI比较差异无统计学意义，认为AI/PI更能客观、准确、稳定地评估软组织肉瘤新辅助放疗的疗效。AI、PI及AI/PI可否作为软组织肉瘤预后判断的指标，还需长期随访，分析其与复发、转移等临床特征的关系，进一步深入研究。

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(本文编辑王艳)

The effect of prepoperative intensity modulated radiation therapy on cell

proliferation and apoptosis in the limb soft tissue sarcoma

ZHOU Yang1， XIE Pengming1， XU Suling2， ZHOU Mei3， BAI Jingping1

(1DepartmentofBoneandSoftTissueOncology,2DepartmentofRadiationOncology，

3DepartmentofPathology，theAffiliatedTumorHospital，XinjiangMedicalUniversity，

Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of preoperative intensity-modulated radiation therapy (IMRT) on proliferation and apoptosis in limbs soft tissue sarcoma. MethodsThe 23 limbs soft tissue sarcoma patients in treatment of preoperative IMRT + surgery between January 2012 and December 2013 in department of Bone and soft tissue oncology of the affiliated tumor hospital in Xinjiang Medical University were selected and analyzed by self-contrast study. The expression of Ki-67 was detected by immunohistochemical technique, indicated with the proliferation index (PI) and apoptosis index (AI) was detected by TUNEL. ResultsPI after IMRT was significantly lower than that before IMRT (P<0.05); AI after IMRT was significantly higher than that before IMRT (P<0.05); AI/PI after IMRT was significantly higher than that before IMRT (P<0.05). Before IMRT, PI and AI in stage Ⅲ were significantly higher than stage Ⅱb; after IMRT, PI in stage Ⅲ was below than that in stage Ⅱb, while AI in stage Ⅲ was higher than that in stage Ⅱb, in which the differences were statistically significant (P<0.05); in clinical staging Ⅱb and Ⅲ, the differences of AI/PI before and after IMRT were statistically significant (P<0.05); before and after IMRT, the differences of AI/PI in different clinical stages were not statistically significant (P>0.05). ConclusionIMRT can induce apoptosis of soft tissue sarcoma cells and inhibit the proliferation, and AI/PI ratio can evaluate the effect of preoperative IMRT in limbs soft tissue sarcoma.

Keywords:intensity-modulated radiation therapy; soft tissue sarcomas; proliferation index; apoptosis index; Ki-67

通信作者：姚华，男，教授，博士生导师，研究方向：健康管理，E-mail：535052988@qq.com。

作者简介：王育珊(1983-)，女，卫生事业管理主管医师，硕士，研究方向：健康管理。

基金项目：新疆维吾尔自治区科技计划项目(201517102)

[收稿日期：2015-04-20]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.017

中图分类号：R738.6

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)01-0077-04