基于NMR代谢组学方法研究异常黑胆质成熟剂对抑郁症大鼠血浆代谢的影响

麦提喀斯木·尼扎木丁, 麦合苏木·艾克木, 买吾拉尼江·依孜布拉, 维妮拉·乌斯曼，

玉苏甫江·台外库力2， 阿不都热依木·玉苏甫2

(新疆医科大学1基础医学院，2维吾尔医学院， 乌鲁木齐　830011)

基于NMR代谢组学方法研究异常黑胆质成熟剂对抑郁症大鼠血浆代谢的影响

麦提喀斯木·尼扎木丁1, 麦合苏木·艾克木2, 买吾拉尼江·依孜布拉2, 维妮拉·乌斯曼2，

玉苏甫江·台外库力2， 阿不都热依木·玉苏甫2

(新疆医科大学1基础医学院，2维吾尔医学院， 乌鲁木齐830011)

摘要：目的从代谢组学角度探讨异常黑胆质成熟剂(ASMq)对抑郁症大鼠血浆代谢物的影响。方法选取60只雄性SD大鼠,进行21 d慢性不可预见性温和应激(CUMS)诱导建立抑郁症大鼠模型(接受应激组),并通过体质量测量、糖水消耗实验、矿场实验进行宏观评价。造模成功后，将接受应激组大鼠随机分为5组：ASMq高、中、低剂量组(给药剂量分别为6.0、3.0、1.5 g/kg)及阳性对照组(氟西汀 3.5 g/kg)、模型对照组(生理盐水 1.5 mL /100 g)，每组12只。另设正常对照组(12只,不接受任何应激，正常饲养)。末次给药1 h后颈椎脱臼处死大鼠，采用核磁共振技术检测6组大鼠血浆代谢物的变化。结果与抑郁模型对照组比较，ASMq 低、中、高剂量组大鼠血浆中肉毒碱、乳酸、β-羟丁酸、肌酸、丙酮酸、丙氨酸、极低密度脂蛋白(VLDL)、络氨酸、糖蛋白、苯丙氨酸、丙酮、甲酸、不饱和脂类含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)。β-葡萄糖、组氨酸、苯丙氨酸、α-葡萄糖含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论ASMq可能通过对抑郁症大鼠的糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢起到一定的调控和改善作用而提高机体兴奋性，治疗抑郁症。

关键词：异常黑胆质成熟剂(ASMq)； 代谢组学； 核磁共振； 抑郁症模型

抑郁症(Depression)又称抑郁障碍，是由多种原因引起的、以抑郁为主要表现的一种精神疾病。杨永勤[1]研究报道，抑郁症每次发作至少持续 2 w以上，长者可至数年，大多数患者有反复发作的倾向，部分患者可有残留症状或转为慢性疾病，因此对抑郁症的预防与治疗迫在眉睫。维吾尔医学(维医)认为，抑郁症的发生与体液发生异常变化，特别是异常黑胆质的增加有关[2]。异常黑胆质成熟剂(ASMq)主要用于治疗异常黑胆质性疾病，其治病原则是成熟体内异常黑胆质，清除致病物质，继而恢复损伤器官的功能直至体液平衡和身体恢复[3]。代谢组学认为人体是一个整体，这种观点与维医以及传统的中医对机体的整体观是一致的。由于血液等体液代谢组包含了机体内每一个细胞的代谢信息，所以异常黑胆质常常是体内代谢发生紊乱的结果,其变化往往会在血液、尿液等体液的代谢组中得到表现。1H 核磁共振氢谱(1H-NMR)方法是很适合研究代谢产物中复杂成分的代谢组学中最多用的化学分析检测技术[4]。在本课题组以往研究的基础上,本研究运用慢性不可预见性温和应激(CUMS)诱导建立大鼠抑郁症模型，采用1H-NMR观察ASMq对抑郁症大鼠血浆代谢物的影响，更加深入系统地探讨ASMq抗抑郁作用的药效作用机理。

1材料与方法

1.1实验动物选取72只雄性清洁级(clean animal，CL)SD大鼠，体质量180~220 g，由新疆医科大学实验动物中心提供[合格证号：SCXY(新)2003-2001]；饲养环境每天光照12 h，温度为(21±3)℃，湿度为46%~55%。

1.2药材与试剂按照本项目组发明的中华人民共和国发明专利(专利号：ZL 02130082.8)制备ASMq(成分同异黑成熟颗粒)。该新药已被国家SFDA受理(受理号为：CXZL1100084)，生理盐水,盐酸氟西汀胶囊 (国药准字J20130010苏州制药有限公司)。重水 (美国cambridge isotop laboratories公司)，生理盐水(国药集团新疆有限公司)，普通蔗糖。

1.3仪器-80℃超低温冰箱和-20℃低温冰箱(中国海尔公司)，600 MHz磁共振波谱仪(美国Varian公司)， TDL-5M型大容量低温离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，BSll05型电子天平(北京赛多科斯天平公司) , AB204-N型分析天平(梅特勒-托勒德公司)，核磁管 (美国wilmad lab glass公司)。

1.4动物模型的建立与评价稳定饲养3 d后，采用CUMS诱导建立大鼠抑郁症模型(接受应激组)。具体造模方法如下：按照文献，大鼠均单笼饲养，使其共接受21 d各种不同的应激，包括电击足底(电压36 V，每隔1 min电击1次，1次持续10 s，共20次)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、热刺激(45℃，5 min)、摇晃(频率160次/min ，3 min)、夹尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、昼夜颠倒，每天随机安排1种，平均每种刺激给予3次。21 d后，采用矿场实验、糖水消耗实验、体质量测量来综合评价模型建立是否成功。

1.5血浆样品制备[5]造模成功后，将接受应激组大鼠随机分为5组：ASMq高、中、低剂量组(给药剂量分别为6.0、3.0、1.5 g/kg)及阳性对照组(氟西汀 3.5 g/kg)、抑郁模型对照组(生理盐水 1.5 mL/100 g)，每组12只。另设正常对照组(12只,不接受任何应激，正常饲养)。每日灌胃给药1次，连续给药21 d。各组大鼠末次给药结束1 h 后，腹腔注射0.5%戊巴比妥钠0.3 mL/100 g体质量进行麻醉，腹主动脉取血2 mL，置于抗凝管中，取血后4℃、3 000 r /min离心15min，分离血清，-80℃保存。

1.6血浆样品的处理取出血浆，常温解冻，10 000 r /min离心10 min，用移液枪吸取400 μL血浆放入离心管中，再加入200 μL磷酸缓冲液(由重水20 mL、超蒸80 mL、NaCl 0.90 g、K2HPO40.829 8 g、NaH2PO40.141 8 g组成，pH=7.0)混合均匀，室温放置10 min，4℃、10 000 r/min离心10 min，吸取上清液550 μL放入5 mm核磁管中等待NMR测试。

1.7NMR 数据采集采用Inova600型核磁共振波谱仪调用NOESYPRESAT-1D(RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ)脉冲序列进行1H核磁共振图谱(1H-NMR谱)测定。NMR条件：1H核共振频率为500.13 MHz，累积扫描64次，采样数据点32 768个，谱宽20 mg/L，采样延迟2 s，每次扫描时间均为1.64 s，测试温度25℃，采用预饱和方法压制水峰。

1.8统计学处理将收集到的核磁共振光谱数据导入Topspin2.0软件, 并手动进行baseline-corrected (基线)及相位矫正, 然后将每个光谱峰积分值以文本格式到 Excel 表内，进行归一化处理。将预处理的NMR谱数据导入SIMCA-P软件(11.0,Umetrics AB,瑞典Umea)，通过多变量统计学方法可视化分析。模型的验证主要参考R2、Q2等参数。R2所解释的是模型差异，Q2是所预测模型的差异，代谢物的相关系数r是用来去确定大鼠的代谢成分是否具有差异性。|r|> 0.532所代表的代谢物差异具有统计学意义(P<0.05)。相关系数绝对值越小表示差异性越小，反之越大。

2结果

2.1各组大鼠血浆一维氢谱正常对照组、阳性对照组、抑郁模型对照组和ASMq 低、中、高剂量组大鼠血浆1H-NMR图谱见图1。

2.2一维氢谱分析结果采用PLS-DA和OPLS-DA分析方法，得到1H-NMR谱的平面分布散点图和3D空间分布图。整体来看，抑郁模型对照组与各个给药组代谢具有一定差异性，ASMq各给药组的代谢模式较为规律，从小剂量组到大剂量组依次向抑郁模型对照组偏离，尤其是ASMq高剂量组与抑郁模型对照组分离较远，其Q2=0.532，见图2。正常对照组和抑郁模型对照组、抑郁模型对照组和ASMq高剂量组、抑郁模型对照组和阳性对照组的分布区域基本完全分开，Q2值依次为0.52、0.623、0.386。其中，正常对照组和抑郁模型对照组的Q2=0.52，见图2~5。说明，此抑郁症造模成功，实验数据可信度较高。

注： A: 正常对照组、B：阳性对照组、C：ASMq中剂量组、D：抑郁模型对照组、E ：ASMq低剂量组、F：ASMq高剂量组

图1各组大鼠的600 MHz1H-NMR谱

■为 正常对照组，●为抑郁模型对照组，◆为阳性组，*为ASMq低剂量组，▲为ASMq中剂量组，■为高剂量组。

图2各组大鼠血浆1H-NMR谱的PLS-DA分析3D空间分布图

A: 散点图; B：3D空间分布图

2.3各组大鼠血浆差异性代谢物的发现与确定各组大鼠血浆差异性代谢物见表1、2，在抑郁模型对照组和ASMq低、中、高剂量组大鼠血浆中差异性代谢物中相关系数的正负值相反。变化明显的主要差异性代谢物为乙酸、肉毒碱、β-葡萄糖、α-葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、β-羟丁酸、 肌酸、异亮氨酸、丙酮酸、丙氨酸、组氨酸、极低密度脂蛋白(VLDL)、络氨酸、糖蛋白、丙酮、苯丙氨酸、不饱和脂类、甲酸等。与抑郁模型对照组比较，ASMq 低、中、高剂量组大鼠血浆中肉毒碱、乳酸、β-羟丁酸、肌酸、丙酮酸、丙氨酸、极低密度脂蛋白(VLDL)、络氨酸、糖蛋白、苯丙氨酸、丙酮、甲酸、不饱和脂类含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)。β-葡萄糖、组氨酸、苯丙氨酸、α-葡萄糖含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

A: 散点图; B：3D空间分布图

A: 散点图; B：3D空间分布图

3讨论

传统维吾尔医学认为，抑郁症属于“麻利胡利亚”范畴，由于长期大量服用干寒型的饮食和药物、情志失常及长期过度从事脑力和体力劳动而使体内正常体液(黑胆质、血液质、黏液质、胆液质)“燃烧”生成异常黑胆质，导致异常黑胆质体液的凝结沉淀，损坏脑部，从而发生异常黑胆质型抑郁症。异常黑胆质导致异常黑胆质型抑郁症的病理过程与CUMS模型不谋而合，代谢的紊乱性变化会在血液等体液的代谢组中得到表现[6]。CUMS模型是抑郁症经典的模型之一，是使动物长时间地接受一系列的温和应激刺激，通过这些刺激模拟人们在平时生活中所遇到的“困难”，模拟出了抑郁症的主要症状表现，同时也模拟出人类抑郁症重要的特征，即快感缺乏。CUMS模型基本符合抑郁模型的要求，具有高度有效性，是目前国内外被已广泛应用于抑郁症基础研究和药物筛选的一种有效的抑郁模型。如阿不都热依木·玉苏甫等[7]成功采用CUMS诱导建立大鼠抑郁症模型。

表1　各组组大鼠血浆主要差异性代谢物及其化学位移和归属层

注：s 为单峰，d 为双重峰，t 为三重峰，q 为四重峰，m 为多重峰。

表2　各组大鼠血浆主要差异性代谢物及其相关系数

注: “-”表示无统计学意义。

本研究采用CUMS建立抑郁症大鼠模型，模型组出现的生物标志物与文献[7]报道的结果相同,说明模型建立成功。ASMq进行药物干预，观察ASMq对抑郁症大鼠血浆代谢物的影响；代谢组学是主要在人体新陈代谢的动态过程中，系统研究一个细胞、组织或器官所有代谢组分，以揭示机体生命活动的代谢本质。然后采用1H-NMR 的PLS-DA的模式识别方法对抑郁模型对照组、ASMq高、中、低剂量组和阳性对照组的血浆进行代谢组分析，结果显示：正常对照组、阳性对照组、抑郁模型对照组和ASMq 低、中、高剂量组可以区分，说明存在明显的代谢差异。

抑郁属于一种强烈的应激反应，能引起DNA氧化损伤[8]。吕路线等[9]通过测定卒中后抑郁病患者血浆、脑脊液中单胺类神经递质水平，再次证明抑郁症患者血及脑脊液中多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HTAA)、高香草酸(HVA)均低于非抑郁正常人群，且这些递质的变化与抑郁量表评分呈负相关。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸均属于芳香族氨基酸，苯丙氨酸和酪氨酸通过脱羧基作用分别生成酪胺和苯乙胺，酪胺和苯乙胺若不能在肝内及时转化，易进入脑组织，分别经 β-羟化酶作用，转化为β-多巴胺(羟酪胺)和苯乙安醇，其结构类似于儿茶酚胺类，故称为假神经递质(false neurotranmitter)。假神经递质增多时，可竞争性地干扰儿茶酚胺，阻碍神经冲动传递，使大脑发生异常抑制，导致抑郁症等疾病。本研究抑郁模型对照组大鼠血浆中酪氨酸含量升高，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，可能是通过脱羧基作用导致抑郁症。酪氨酸在肾上腺髓质和神经组织酪氨酸羟化酶(tyrosina hydroxylase)催化生成3,4-二羟苯丙氨酸(多巴 DOPA)，在多巴脱羧酶的作用下，多巴脱去羧基生成多巴胺(dopamine)，多巴胺侧链的β-碳原子再被羟化生成去甲肾上腺素(norepinephrine),后者甲基化生成肾上腺素(epinephrine)。ASMq低剂量组苯丙氨酸和酪氨酸含量显著下降，与抑郁模型对照组比较，差异有统计学意义(P< 0.05)。提示ASMq使酪氨酸的代谢物(去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺)显著增加，神经递质增加会提高机体兴奋性。

抑郁症特征症状之一是情绪低落，情绪低落具有促进脂质过氧化作用[10]。乳酸则在糖代谢和能量代谢中不可缺少。抑郁模型对照组大鼠血浆中不饱和脂肪酸含量升高，乳酸含量增加的结果可能与机体存在能量代谢障碍和氧化损伤有关。不同剂量的ASMq能够降低肉毒碱、乳酸、不饱和脂肪酸的含量，与抑郁模型对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。提示ASMq可改善抑郁症大鼠的能量代谢，减轻氧化损伤。肌酸和磷酸肌酸是体内能量储存、利用的重要化合物，一部分从饮食中获得，另一部分是由肝脏合成。肌酸在体内以甘氨酸为骨架合成后转变成磷酸肌酸即储存三磷酸腺苷(ATP)的高能磷酸键。肌酸和磷酸肌酸代谢的最终产物是肌酸酐。本研究中抑郁模型对照组大鼠血浆中肌酸含量的升高提示抑郁症患者体内能量代谢的紊乱；高剂量ASMq能降低抑郁模型对照组大鼠血浆中肌酸含量，提示ASMq能调控肌酸合成代谢。组氨酸被认为是一种人类必需的氨基酸，在组氨酸脱羧酶的作用下，组氨酸脱羧形成组胺。组胺具有很强的血管舒张作用，并与多种变态反应及发炎有关。组氨酸能被降解成氨、谷氨酸和甲酰胺，参与基础能量代谢。体内组氨酸酶催化组氨酸脱氨生成尿苷酸的代谢途径受阻，引起组氨酸积聚，组氨酸浓度显著升高，尿中组氨酸含量增多。组氨酸积聚症患者临床表现为智力低下、精神运动和总体落后、语言障碍、情感障碍等。本研究表明ASMq能够明显升高抑郁症大鼠血浆组氨酸含量(P<0.05)，给药以后参加血浆代谢的组氨酸的含量增高，提示ASMq参加调控机体基础能量代谢过程。

总之，ASMq可使抑郁模型对照组大鼠血浆中差异性代谢物的含量产生相应的变化，从代谢组学角度来看，ASMq对抑郁症大鼠的血浆代谢紊乱起到一定的调控和改善作用。

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(本文编辑周芳)

NMR based plasma metabonomic study of Abnormal Savda Munziq′s

effect on the depression rat model

Maitikasimu Nizhamuding1, Maihesumu Aikemu2, Maiwulanijang Nizibula2，Weinila Wusiman2,

Yusufujiang Taiwaikuli2，Abudureyimu Yusupu2

(1SchoolofPre-clinicalMedicine,2SchoolofTraditionalUyghurMedicine,

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo observe the effects of Abnormal Savda Munziq (ASMq) on endogenous metabolic changes in plasma in depression rat model to explore the internal mechanisms of ASMq in the point of view of metabonomic. MethodsDepression model was established on 72 male SD rats using chronic unpredictable mild stress method (CUMs). Then, serum samples from all groups were analyzed by nuclear magnetic resonance technology. ResultsCompared to the control group, serum levels of isoleucine, lactic acid, creatine, glutamine, tyrosine, sugar, protein, fat, unsaturated lipids, β-hydroxybutyric acid, acetic acid, alanine, α-, β-glucose and glucose were significantly increased (P<0.05) in the depression model group, while serum level of histidine was significantly decreased (P<0.05). In contrast to the depression model group, serum level of histidine, α-glucose, β-glucose are significantly increased (P<0.05) in the low, medium and high dose of ASMq groups, while serum levels of carnitine, lactic acid, β-hydroxybutyrate butyric acid, creatine, pyruvic acid, phenylalanine, alanine, lipid (VLDL, LDL), unsaturated lipids, acetone, tyrosine, glycoproteins and acid content were decreased significantly (P<0.05) in all ASMq groups. ConclusionASMq may improve the body excitability and treat depression in rats by improving and regulating the glucose, lipid and amino acid metabolism .

Keywords:Abnormal savda munziq (ASMq); metabolomics; NMR; depression model

通信作者：阿不都热依木·玉苏甫，男(维吾尔族)，博士，教授，博士生导师，研究方向：维吾尔医基础理论及新药开发，E-mail：ayusup@126.com。

作者简介：玉苏甫江·台外库力(1983-)，男(维吾尔族)，在读硕士，研究方向：维吾尔医基础研究。

基金项目：国家自然科学基金(81360667)

[收稿日期：2015-09-25]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.001

中图分类号：R291.5

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)01-0001-06