3.0T MR多序列示踪SPIO标记骨髓间充质干细胞在SCI大鼠模型中的对比研究

陈　乐， 张德清， 王　俭， 姜春晖， 依巴努·阿不都热合曼， 马　艳， 江　明

(新疆医科大学第一附属医院1影像中心，2干细胞实验室，3血液科， 乌鲁木齐　830054)

3.0T MR多序列示踪SPIO标记骨髓间充质干细胞在SCI大鼠模型中的对比研究

陈乐1， 张德清1， 王俭1， 姜春晖1， 依巴努·阿不都热合曼1， 马艳2， 江明3

(新疆医科大学第一附属医院1影像中心，2干细胞实验室，3血液科， 乌鲁木齐830054)

摘要：目的探索3.0T MR活体示踪移植SPIO标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)在大鼠脊髓损伤(SCI)模型中的优选序列。方法采用贴壁法培养大鼠BMSCs，使用超低微浓度的菲立磁-硫酸鱼精蛋白(Fe-Pro)标记BMSCs，普鲁士蓝及核固红染色显示细胞内铁。将20只脊髓损伤(SCI)模型的SD大鼠，于建模后第7天在损伤区两侧局部多点注射Fe-Pro标记的BMSCs，并于移植后第14天行3.0T MR FSET2WI、3DFIESTA、ESWAN序列成像，测量损伤区标记干细胞信号变化率及图像信噪比，并与脊髓组织切片普鲁士蓝染色对照。结果20只SD大鼠BMSCs标记率为100%。脊髓普鲁士蓝染色显示，损伤区附近细胞质内大量细小蓝染颗粒。标记干细胞在3种MR序列图像上的信号变化率分别为(43.40±3.20)%、(77.80±3.59)%、(79.60±3.58)%，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，FSET2WI序列的信号变化率均小于3DFIESTA及ESWAN序列的信号变化率，差异有统计学意义(P<0.05)；3DFIESTA及ESWAN序列间信号变化率比较差异无统计学意义(P>0.05)。标记干细胞在3种MR序列图像信噪比分别为(20.95±1.91)、(45.70±9.40)、(44.50±8.29)，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，FSET2WI序列的信噪比均小于3DFIESTA及ESWAN序列的信噪比，差异有统计学意义(P>0.05)； 3DFIESTA及ESWAN序列间信噪比比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论3.0 T MR FSET2WI、3DFIESTA、ESWAN序列均可以检测到SPIO标记的BMSCs在大鼠脊髓内的MR信号，ESWAN序列效果最佳。

关键词：超顺磁性氧化铁颗粒； 大鼠骨髓间充质干细胞； 脊髓损伤； 磁共振成像； 示踪

随着MR无创性示踪移植干细胞在活体内生物学行为研究的广泛开展[1-2]，使MR活体示踪移植干细胞治疗大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的研究成为可能。大鼠价格低廉，容易管理，被大量用于移植干细胞治疗SCI的相关试验研究中[3-4]。但小动物的MR扫描存在弊端，以往的研究多使用二维GRET2*WI序列进行活体示踪，很难精确和长时间检测SPIO标记BMSCs在大鼠脊髓内的MR信号[5-6]。因此，如何使用更为先进的薄层扫描技术动态检测标记干细胞在体内的分布无疑成为研究的重点。本研究在前期超低微浓度菲立磁-硫酸鱼精蛋白复合物标记大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)研究的基础上[7]，使用3.0T磁共振扫描仪，对比常规二维成像序列及三维薄层成像序列在移植超顺磁性氧化铁颗粒(superparamagnetic iron oxide particles, SPIO)标记干细胞活体示踪中的成像效果，旨在选择一种更为有效的活体示踪SPIO标记干细胞的成像序列。

1材料与方法

1.1 实验动物4～6周龄清洁级SD(Sprague Dawley)大鼠，体质量100~140 g，用于移植BMSCs供体。7周龄雌性SD大鼠，体质量230~250 g，用于移植BMSCs受体。所有大鼠均由新疆医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(新)2003-001。

1.2主要试剂与设备菲立磁(Fe，美国先进磁力公司)，硫酸鱼精蛋白(Pro, Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，低糖DMEM培养基(Gibco公司，台盼兰(Sigma公司)，普鲁士蓝及核固红(Sigma公司)，超净工作台(苏州净化)，CO2培养箱(香港HEAL FORCE 公司)，正置显微镜(德国Leica公司)，倒置显微镜(德国Leica公司)，离心机(德国Joran公司)，3.0T磁共振成像系统(signa HDXT，美国GE公司)。

1.3大鼠BMSCs分离、纯化、培养及磁性标记参照本课题组前期实验方法[7]。

1.4BMSCs普鲁士蓝染色细胞标记结束后，去除培养液，PBS冲洗3次，光镜下观察细胞内外铁聚集情况后，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，perls液孵育15 min，PBS漂洗3次，1%核固红复染20 min。

1.5大鼠SCI模型制备制备大鼠脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)模型20只，大鼠麻醉后(氯胺酮8 mL+地西泮8 mL+阿托品4 mL生理盐水稀释至40 mL，0.75 mL/100 g体质量腹腔注射麻醉)。切开大鼠背部皮肤和肌肉，用特制椎板钳咬除胸8(T8)及胸9(T9)棘突及椎板，暴露硬脊膜，纤维镊子钳夹T9段脊髓0.5 s，造成完全损伤，以大鼠双后肢猛烈收缩、尾巴旋转1 周判断为造模成功。依次缝合肌肉和皮肤。每日腹腔注射青霉素钠(16万U)，连续注射3 d，预防术后感染。每日早、晚膀胱按摩挤尿2次，直至大鼠恢复自主排尿功能。

1.6BMSCs移植于建模后第7天分别将20只SCI大鼠腹腔灌注麻醉，拆除缝线，暴露脊髓损伤区域，用微量注射器将10 μL细胞悬液(含1×106个标记细胞/未标记细胞)缓慢注入损伤区远端0.5 cm处，缝合肌肉、皮肤。

1.73.0 T MR成像序列、扫描参数及数据测量移植后第14天使用多通道腕关节线圈对大鼠行MR扫描。成像序列：二维快速自旋回波T2WI序列(fast spin echo, FSE T2WI)、三维稳态采集快速成像序列(three-dimensional fast imaging employing steady state acquisition, 3DFIESTA)、多回波采集的重度T2*加权的三维梯度回波序列(enhanced T2 star weighted angiography, ESWAN)。成像参数：FSE序列 TR 1 560 ms，TE 120.3 ms，带宽31.20 KHz，FOV 10 cm×10 cm，层厚1.0 cm，矩阵320×256，激励次数4；3DFIESTA序列 TR 8.1 ms，TE 2.6 ms，带宽62.50 KHz，视野12 cm×12 cm，层厚0.8 cm，矩阵320×320，激励次数 2，反转角60°；ESWAN序列TR 85 ms，TE 2.4 ms，带宽41.67 KHz，视野12 cm×12 cm，层厚1.7 mm，矩阵448×320，激励次数 1，反转角 15°。分别计算SPIO标记干细胞的信号变化率及图像信噪比(signal noise ratio, SNR)。测量各感兴趣区(ROI)的信号强度，信号变化率计算公式：△SI=[(SIL-SIU)/SIU]×100% (△SI为信号变化率，SIL为损伤区标记细胞信号，SIU为损伤区周围脊髓信号)。图像SNR计算公式：SNR=SI组织/SD背景(SI组织为组织ROI信号强度平均值，SD背景为图像相位编码方向视野内组织外ROI信号强度标准差)。

1.8组织学指标于MR扫描结束后，取1只大鼠，腹腔灌注麻醉，切开胸腔，暴露心脏，剪除右心耳，心间部依次灌注60 mL生理盐水及10%甲醛，直至大鼠后肢伸直，僵硬。切开背部皮肤、肌肉，椎板钳咬除棘突及椎板，暴露脊髓，取损伤中心周围3 cm内的脊髓段10%甲醛浸泡24 h后，连续石蜡切片，行HE和普鲁士蓝染色。

1.9统计学处理应用SPSS17.0软件进行统计学分析，3种序列标记BMSCs 信号变化率及图像信噪比(signal-to-noise ratio，SNR)比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD多重对比检验。所有数据均使用均数±标准差(-x±s)表示，双侧检验α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1BMSCs标记效果观察BMSCs接种后48 h，可见大量细胞集落形成，单个细胞可见短小突起形成，7~8 d细胞融合达90%左右，细胞成纤维样生长，以后每隔5 天传代1次；直至传至3代，细胞形态一致，无明显折光性。细胞标记结束后直接行普鲁士蓝及核固红染色，所有细胞质内均可见细胞蓝染颗粒，细胞外无明显蓝染颗粒(图1)。

2.2MRI表现、不同序列间信号变化率及信噪比的差异移植后第14 天FSE、3DFIESTA、ESWAN扫描序列图像上于脊髓损伤区周围标记的BMSCs均呈低信号(图2a、2b、2c)。不同序列间信号变化率组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，多重对比LSD检验，FSET2WI序列的信号变化率均小于3DFIESTA及ESWAN序列的信号变化率，差异有统计学意义(P<0.05)，3DFIESTA及ESWAN序列间信号变化率比较差异无统计学意义(P>0.05)。标记干细胞在3种MR序列图像信噪比组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。多重对比LSD检验，FSET2WI序列的信噪比均小于3DFIESTA及ESWAN序列的信噪比，差异有统计学意义(P<0.05)，3DFIESTA及ESWAN序列间信噪比比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

a: FSET2WI序列

b: 3DFIESTA序列

c: ESWAN序列

图2 FSE T2WI序列、3DFIESTA序列、ESWAN序列于脊髓损伤区周围标记的BMSCs均呈低信号

表1FSET2WI、3DFIESTA、ESWAN扫描序列信号变化率及信噪比(-x±s)

序列信号变化率/%信噪比FSET2WI43.40±3.2020.95±1.913DFIESTA77.80±3.59*45.70±9.40*ESWAN79.60±3.58*44.50±8.29*F值61.68694.84P值0.0000.000

注: 与FSE T2WI比较，*P<0.05。

2.3组织学观察脊髓病理切片普鲁士蓝染色显示大量蓝染标记细胞分布于脊髓内(图3)。

图3　SPIO标记BMSCs移植后第14天脊髓组织普鲁士蓝染色(×200)

3讨论

SCI曾被认为是一种不能恢复的损伤，治疗方法虽多，但治疗效果不佳。随着干细胞移植治疗技术的发展，以往的研究结果显示移植BMSCs具有向大鼠SCI中心迁移、聚集的现象，能够表达神经细胞表型，促进SCI神经结构的修复和神经功能的恢复[8]。但是以往的研究常采用免疫荧光标记等方法标记移植干细胞，分批次将动物处死后行病理学检查，观察移植干细胞在脊髓内的分布和迁移等生物学行为，其程序复杂，且不能够连续示踪移植干细胞在体内的生物学行为，同时增加了试验成本，不能够最大限度地提高实验动物的利用效率。MR由于具有良好的软组织和空间分辨率，同时具有无放射线损伤等优点，且已有研究证实MR可以对SPIO标记后的移植干细胞进行活体示踪的可行性[5]。SPIO是一种网状内皮系统MR造影剂，具有强大的顺磁性作用，分布于组织后，造成组织局部磁场的不均匀性，可以明显地缩短组织横向弛豫时间，同时结合一定比例的阳离子转染剂多聚左旋赖氨酸或硫酸鱼精蛋白可以对干细胞进行磁性标记。梯度回波(GRE)序列不具备常规自旋回波序列所具有的180°相位重聚焦脉冲的匀场作用，不能有效地剔除主磁场不均匀造成的质子失相位，因此对SPIO造成的磁场不均匀较常规自旋回波(SE)序列更为敏感。故以往的研究常采用GRET2*WI进行标记干细胞的活体示踪研究[1,9]。但由于大鼠脊髓体积较小，标记干细胞信号范围微小，需要薄层扫描方能显示移植干细胞的具体位置和分布。但常规二维 GRET2*WI扫描技术不具备连续薄层扫描的能力，往往需要一定的层间距，容易遗漏标记干细胞信号的显示。人为缩小层间距，往往会产生严重的层间干扰，影响图像信噪比。同时常规二维GRET2*WI容易产生明显的横带伪影，影响图像质量。本研究曾尝试采用GRET2*WI进行大鼠脊髓薄层扫描，但图像伪影明显，且标记细胞信号放大、变形严重。

3DFIESTA序列是在常规二维GRE序列的基础上增加了横向磁化矢量相位重聚梯度，利用三维傅立叶变换重组采集法，具有连续无层间距的薄层扫描技术，可以显示组织的细微结构，且具有良好的图像对比度。目前多应用于脑神经的相关研究中，其可使脑神经与脑脊液的信号对比更明显，后处理软件任意角度的三维旋转可使神经的细微结构完整显示。但该序列扫描时间较长，且容易受呼吸运动的影响而出现伪影，对条件难以控制的动物实验来说具有一定局限性。其次，该序列磁敏感效应重，易出现磁敏感伪影。本研究选用SPIO标记移植干细胞造成局部磁场不均匀，选用3DFIESTA序列虽然可以提高MR信号变化检出的敏感性，但图像伪影影响了其示踪效果。

ESWAN序列是在传统磁敏感加权成像技术的基础上改进的一种三维薄层扫描方法，是在磁敏感加权成像(susceptibility weighted imaging，SWI)的基础上建立起来的一种新的利用组织间磁敏感的内在差异作为对比的成像技术。其除了具备常规SWI序列所具有的完全流动补偿、高分辨率、高信噪比的特点外，ESWAN的多回波采集方式使1次扫描可以获得多个回波的幅度图和相位图，使对磁敏感效应的敏感性最大化，可提高MR信号变化的检出率。同时由于其成像时间短，能够很好地消除运动伪影。本研究显示ESWAN序列可以连续显示标记干细胞信号达数层，且信号变化率和图像SNR明显高于FSET2WI，于移植后第14 天清晰显示标记干细胞在大鼠脊髓内的部位和范围，而FSET2WI图像上标记细胞信号明显增高,范围明显缩小，持续使用ESWAN序列观察，发现于干细胞移植后31 d仍能检测到标记干细胞MR信号。

本研究显示3.0T MR FSET2WI、3DFIESTA、ESWAN序列均可以检测SPIO标记BMSCs在大鼠脊髓内的MR信号，而且3DFIESTA、ESWAN序列MR信号变化的检出率和信噪比均高于FSET2WI，但是3DFIESTA序列因图像伪影而导致示踪效果不够真实，因此ESWAN序列示踪效果最佳，为今后深入研究SPIO标记BMSCs在大鼠SCI模型体内的生物学行为提供了良好的影像学检测手段。

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(本文编辑杨晨晨)

Comparision of different 3.0T MR sequences in tracing SPIO-labeled

mesenchymal stem cells of SCI rats

CHEN Le1， ZHANG Deqing1， WANG Jian1， JIANG Chunhui1， Yibanu Abudureheman1，

MA Yan2， JIANG Ming3

(1MRIRoom，DepartmentofImagingCenter,2StemCellLaboratory,3DepartmentofHematology,

theFirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract：ObjectiveTo explore a optimum 3.0 T MR sequence for tracing the fate of SPIO-labeled bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in vivo. MethodBMSCs were isolated and expanded by means of differential adhesion method and then labeled with Fe-Pro complexes. Prussian and Nuclear Fast Red were performed for showing intracellular irons. Fe-Pro labeled BMSCs was locally injected into both sides of the damaged areas in multiple spots into the 20 spinal cord injury (SCI) model rats 7 days after the injury. 3.0TMR FRFSET2WI, 3DFIESTA, ESWAN sequences were performed to gain MR imaging 14 days after transplantation, then signal-to-noise ratio (SNR) of spinal cord and signal rate of labeled cells as well as comparison with Prussian traced spinal cord tissue were obtained. ResultIn the 20 SD rats, BMSCs was 100% labeled. Prussian blue staining: Iron-containing intracytoplasmic vesicles can be observed clearly in cytoplasmic nearby injury with Prussian blue staining. The signal rate of labeled cells was (43.40±3.20)%, (77.80±3.59)% and (79.60±3.58)% respectively on the three sequences where there were significant differences in group comparisons (P<0.05). The signal changing rate of FSET2WI sequence was below than that of 3DFIESTA and ESWAN sequences (P<0.05), while there was no significant difference between the signal changing rate of 3DFIESTA and that of ESWAN sequences (P>0.05). The SNR of labeled stem cells were (20.95±1.91), (45.70±9.40) and (44.50±8.29) respectively on the three sequences where there were significant differences in group comparison (P<0.05), in which the SNR of FSET2WI sequence was lower than that of 3DFIESTA and ESWAN sequences (P<0.05), while there was no significant difference between the SNR of 3DFIESTA and ESWAN sequences (P>0.05). ConclusionThe MR signal of SPIO-labeled BMSCs can be detected by 3.0T MR FRFSE T2WI, 3DFIESTA, and ESWAN sequences. Moreover, ESWAN sequences show best effect.

Keywords:superparamagnetic iron oxide particles; bone marrow mesenchymal stem cells; spinal cord injury; magnetic resonace; tracing

[收稿日期：2015-05-30]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.007

中图分类号：R-331

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)01-0032-05