食品中12种添加剂的检测

文/ 刘浩 赵广西 杨铮

食品中12种添加剂的检测

文/ 刘浩 赵广西 杨铮

固相萃取－HPLC联用法检测12种常用食品添加剂

本实验建立了同时检测12种食品添加剂的方法，样品前处理简单快捷、回收率高，杂质干扰得到有效控制；色谱分离效果好；结果重现性好、检出限低，可满足各类食品中多种添加剂同时检测的需求，能够节约实验成本。

本研究选取食品加工中最常用的防腐剂、甜味剂及人工合成色素共计12种食品添加剂（苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜、柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红）进行研究。国家标准及文献报道中很少有多种添加剂同时检测的方法，而使用传统方法检测时间长、工作量大。因此建立一种既快捷又准确，能同时测定食品中12种食品添加剂的检测方法十分必要。本文参考相关资料，样品前处理采用固相萃取技术富集、净化，使用高效液相色谱仪进行分析，同时检测各类食品样品中的12种添加剂，并对各试验参数进行了优化。结果显示，本法简单快捷、灵敏度高, 适用于各类食品样品中添加剂的测定。

实验条件

主要材料与试剂

苯甲酸标准溶液、山梨酸标准溶液、安赛蜜标准品、糖精钠标准品、柠檬黄标准溶液、日落黄标准溶液、苋菜红标准溶液、胭脂红标准溶液、诱惑红标准品、赤藓红标准品、亮蓝标准溶液、靛蓝标准品均来自国家标准物质研究中心；甲醇（迪马公司）；乙酸铵（天津市化学试剂三厂）。

主要仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦）；台式高速离心机；超声波清洗仪；旋涡混合器（国力天科技有限公司）；固相萃取小柱（Waters Oasis WAX，预先经5 ml甲醇、5 ml水、2%的甲酸水溶液5 ml活化)；样品：超市和市场购买。

色谱条件

色 谱 柱：CNW Athena C18-WP (4.6×250 mm,5 µm)；柱温：20.0℃；流动相：A：甲醇，B：乙酸铵溶液（0.02 mol/ L+5%甲醇），梯度洗脱见表1；流速1 ml/min；进样量10 µl；检测器：紫外检测器；检测波长：柠檬黄428 nm、苋菜红521 nm、日落黄483 nm、胭脂红509 nm、亮蓝630 nm、靛蓝608 nm、胭脂红509 nm、诱惑红和赤藓红波长530 nm、山梨酸和苯甲酸 230 nm、糖精钠和安赛蜜214 nm。

液体样品处理

称取液体样品10 ml于100 ml离心管中,加入0.2 ml甲酸，涡旋混匀1 min后，超声提取10 min，离心，经0.45 µ m滤膜过滤，取5 ml上已活化的Oasis WAX柱，依次以10 ml的2%甲酸淋洗，5 ml的5%氨水甲醇溶液洗脱，氮吹浓缩到1 ml进样。

固体样品处理

称取固体样品2 g于100 ml离心管中,加入25 ml乙醇：氨水：水(9：0.5：0.5)混合溶剂匀浆，涡旋1 min后超声提取30 min、离心、残渣重复提取2次，合并提取液旋蒸定容10 ml，经0.45 µm滤膜过滤，取5 ml上已活化的Oasis WAX柱，依次以10 ml的2%甲酸淋洗，5 ml的5%氨水甲醇溶液洗脱，氮吹浓缩到1 ml进样。

表1.流动相梯度洗脱程序

实验与分析

前处理的选择

食品样品基质复杂，而且同时检测12种添加剂并保证结果准确、回收率高，这对前处理提出了很高的要求。几种添加剂均可溶于水因此文献往往采用直接滤膜过滤后检测，但对于基质复杂的样品，极易造成系统的污染。选择合适的前处理方法，可以去除杂质，降低基线杂质噪音。文献中前处理的步骤往往繁琐耗时、回收率偏低，本文从添加剂自身化合物性质出发，结合文献设计了样品前处理方法。

沉淀剂

部分固体样品中含有蛋白质，如果蛋白沉淀剂选择不当，将对后期实验产生严重影响，实验考察了乙腈、乙酸锌-亚铁氰化钾去除蛋白，但这一过程中部分防腐剂、色素也被沉淀吸附，会降低回收率。作者采用氨水：乙醇：水溶液进行提取。糖精钠、苯甲酸和山梨酸在碱性条件下以盐的形式存在，可以溶于强极性的溶剂。安赛蜜易电离，合成色素是水溶性化合物，易溶于水及极性溶液；浓度90%以上的乙醇又可以使蛋白质脱水，促进蛋白质的凝聚，同时乙醇可起到破坏沉淀胶体减少干扰的作用。本文通过对不同比例的氨水乙醇水溶液进行比较，最终确定实验比例。

固相萃取柱

提取液可同时将糖和某些脂溶性成分提取出，影响基线稳定性并形成杂质干扰，所以选取固相萃取小柱进行净化。根据文献试验考察了不同分离模式的固相萃取柱，包括：反相C18-HLB固相萃取柱)和弱阴离子交换WAX柱固相萃取柱、强阴离子交换MAX固相萃取柱。HLB柱以亲水一亲脂共聚物吸附剂为固定相，实验发现HLB柱对安赛蜜、糖精钠和胭脂红、赤藓红回收率较低，尤其赤藓红仅在20%左右。所以试验又对其他小柱进行了考察，强阴离子交换MAX无法保留糖精钠、安赛蜜、苯甲酸、山梨酸，实验中，糖精钠、安赛蜜、苯甲酸、山梨酸回收率仅为35%，原因可能是当pH为8～9时，这四种物质的分子状态不稳定，无法保留在MAX柱上。

Oasis WAX属于混合型弱阴离子交换反相吸附柱，可以有效地去除杂质干扰，提高回收率。几种甜味剂和防腐剂同时带有有机官能团和可离子化官能团在中性和偏酸性条件下，电离效果降低，主要以中性分子的形式存在，利用反相柱的吸附作用形成保留。而赤藓红为苯甲酸钠结构，也存在一定保留，其他合成色素为苯磺酸钠结构含有磺酸基，属强阴离子化合物，利用弱阴离子交换作用形成保留效果。实验发现赤藓红回收率偏低，可能是赤藓红的苯甲酸钠结构，相对其他苯磺酸钠结构的着色剂，保留较弱；其次甲醇及甲酸可对赤藓红部分洗脱，与小柱结合较弱的赤藓红也被部分洗脱；另外混合纤维素膜对赤藓红有较强吸附，常用的聚醚砜和尼龙滤膜对部分色素也有很强的吸附作用，最后采取0.45 µm聚四氟乙烯滤膜过滤。

图1. 12种添加剂标准分离谱图。

流动相的选择

实验选取纯水和甲醇、乙腈-乙酸铵、甲醇-乙酸铵体系分别进行考察。发现纯水和甲醇流动相无法使安赛蜜、苯甲酸和山梨酸有效分离。可能是因为中性条件下，部分甜味剂和防腐剂以阴离子的形式存在，与色谱柱的固定相之间的作用较弱，分离效果差；在弱酸性流动相中可使苯甲酸和山梨酸主要以中性分子形式存在，与固定相之间的相互作用显著增强，分离效果得到明显改善。试验表明，合成色素的分离效果受pH值影响较小。

乙腈-乙酸铵体系无法使部分合成色素（如胭脂红、日落黄）有效分离，而甲醇-乙酸铵各添加剂得到有效分离、峰形最佳。进一步选用0.01 mol/ L、0.02 mol/L、0.03 mol/L、0.04 mol/L进行实验。发现在0.02 mol/L时各种添加剂的峰形和分离效果达到最佳；当浓度再增大时，峰形和分离效果无明显增强。这主要是因为弱酸性的中乙酸铵缓冲盐溶液含有羧酸基团可对甜味剂和防腐剂有更强的洗脱能力，因此最终选用0.02 mol/L甲醇-乙酸铵流动相体系。

检测波长的确定

柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、赤藓红、诱惑红、亮蓝、靛蓝8种合成色素的化学结构中均含有苯磺酸基，有较强的紫外吸收特性。同时各种色素的化学结构中所含的发色团及助色团不同而呈现不同的颜色，在可见光区也有各自的较强的吸收。标准溶液分别用紫外光谱仪进行扫描，发现在210 nm附近处有较大吸收峰，但由于样品中很多干扰物在此波长下都有吸收，因此优先选择可见波长作为测定波长，经过反复试验，最后确定为：柠檬黄428 nm、苋菜红521 nm、日落黄483 nm、胭脂红509 nm、亮蓝630 nm、靛蓝608 nm、胭脂红509 nm、诱惑红和赤藓红波长530 nm。GB/T 5009.35-2003第一法选择254 nm波长检测，其他色素可以很容易的检出，只有亮蓝灵敏度很低，选择可见光区的最大吸收波长检测后，亮蓝和赤藓红的灵敏度明显提高并且干扰物影响小。

作者对甜味剂和防腐剂标准溶液进行紫外扫描发现最大吸收波长分别为：安赛蜜226 nm、糖精钠202 nm、苯甲酸224 nm、山梨酸253 nm。由于流动相在低于200 nm下有吸收，会造成噪音过高，250 nm处苯甲酸、糖精钠灵敏度太低不能满足检测需要，为此选230 nm为苯甲酸、山梨酸的检测波长。安赛蜜、糖精钠的最大吸收波长分别在226 nm及202 nm处，本实验结合文献作者选取灵敏度相近的214 nm处进行检测。

干扰试验

在实际样品检测中发现, 某些食品基质中可以对安赛蜜与糖精钠的测定造成干扰。如酒类产品中的糠醇等存在与糖精钠接近的化学结构,保留时间与吸收光谱均类似，易造成假阳性判定。建议进行加标试验或辅助进行光谱扫描或串联荧光检测器，进行验证。

标准曲线及检出限

将12种标准品用水配制成浓度分别为：0.02 mg/ml、0.04 mg/ml、0.06 mg/ ml、0.08 mg/ml、0.10 mg/ml的标准溶液进样分析，得到色谱图，以峰面积为纵坐标，标品进样量为横坐标，获得标准曲线，计算线性回归方程及相关系数，见表2。

表2. 回归分析结果和检出限

表3. 不同食品的测定结果回收率

结果与分析

回收率的分析

取5 种不同类型食品，分别用本方法制成样品溶液，分别加入一定量的标准品溶液，使标品浓度分别为0.02 mg/ ml、0.04 mg/ml、0.06 mg/ml、0.80 mg/ ml、0.10 mg/ml，按上文样品前处理方法进行处理后检测，回收率见表3，可以满足检测要求。

实际样品分析

本文研究针对市场上的20种食品样品进行了抽检。经过分析可得出结论，添加防腐剂、甜味剂、色素较为常见，部分散装食品中检出合成色素和甜味剂，并部分超标。

目前国家标准中对于防腐剂、甜味剂、合成色素三类食品添加剂的检测方法多为单独检测，即使查一些文献资料，也多是关于同一类多种添加剂、防腐剂或甜味剂的同时检测方法。而关于三类食品添加剂同时检测的研究报道比较少。这主要是因为，三类食品添加剂的样品前处理方式稍有不同，其中，防腐剂和甜味剂的前处理多为溶解稀释过程，而合成色素还需要净化和富集。同时由于食品基质复杂、杂质干扰大，回收率难以满足要求，导致实验结果难以令人满意。

小结

本研究从目标物的化学结构出发，充分考虑样品基质的复杂性，优化选择了合适的蛋白沉淀剂和固相萃取柱，建立了适合的前处理方法，并通过对色谱柱、流动相和检测波长的选择，进一步优化色谱条件，建立了一种多类型食品添加剂同时检测的方法，可同时检测各类食品中的苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠、柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红12种添加剂的含量。本方法样品前处理简单快捷，回收率高；杂质干扰得到有效控制，色谱分离效果好；检测选择性强，重现性好,检出限低，可以满足各种类食品中添加剂检测要求，能够节约大量的实验成本。

本文作者来自国家葡萄酒质量监督检验中心。