魔芋葡甘露聚糖对Lewis肺癌小鼠细胞免疫功能的影响

潘 磊周 翡陈培丰

·经验交流·

魔芋葡甘露聚糖对Lewis肺癌小鼠细胞免疫功能的影响

潘 磊1周 翡2陈培丰1

目的观察中药蛇六谷主要成分魔芋葡甘露聚糖（KGM）对肺癌小鼠免疫功能的影响。方法建立小鼠Lewis肺癌模型后，随机分成KGM高、中、低剂量组及对照组、环磷酰胺（CTX）组。建模第2天起，KGM高、中、低剂量按300、200、100mg/（kg·d）连续灌胃13天，对照组以等剂量生理盐水灌胃13天，环磷酰胺组予环磷酰胺30mg/kg每周2次腹腔注射给药，共4次。第14天处死小鼠，取瘤体、脾脏称重并计算抑瘤率和脾脏指数，MTS法检测脾脏中T淋巴细胞增殖活力，ELISA法检测脾细胞IL-2的表达。结果（1）与对照组比较，CTX组、KGM中、高剂量组瘤重降低明显，差异有统计学意义[（0.69±0.50）g、（1.71±0.95）g、（1.54±0.83）g比（2.51±1.11）g，P＜0.05]；KGM低、中、高剂量组瘤重高于CTX组，差异有统计学意义[（2.15±0.88）g、（1.71±0.95）g、（1.54±0.83）g比（0.69± 0.50）g，P＜0.05]。（2）与对照组比较，CTX组脾脏指数降低[（2.73±1.19）mg/g比（4.61±0.69）mg/g，P＜0.01]，KGM各剂量组脾脏指数升高，其中KGM中、高剂量组差异有统计学意义[（5.93±0.88）mg/g、（6.02±1.47）mg/g比（4.61±0.69）mg/g，P＜0.05]。（3）与对照组比较，CTX组T淋巴细胞增殖反应能力下降[（0.4055±0.2295）比（0.6125±0.0719），P＜0.05]，KGM各剂量组增强，其中KGM高剂量组最强[（0.8198±0.0251）比（0.6125±0.0719），P＜0.05]；与CTX组比较，KGM各剂量组的T淋巴细胞增殖反应能力均增强[（0.6338±0.1027）、（0.70±0.0966）、（0.8198±0.0251）比（0.4055±0.2295），P＜0.05]。（4）与对照组比较，CTX组IL-2下降[（434.43±44.64）pg/mL比（552.98±27.99）pg/mL，P＜0.05]，KGM各剂量组上升[（664.69±30.46）pg/mL、（830.83±71.42）pg/mL、（1058.47±70.58）pg/mL比（552.98±27.99）pg/mL，P＜0.05]，且KGM各剂量组两两比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论KGM通过提高Lewis肺癌小鼠脾脏T淋巴细胞增殖，上调脾细胞IL-2表达，提高其免疫功能，从而发挥抗肿瘤作用。

小鼠；Lewis肺癌；魔芋葡甘露聚糖；T淋巴细胞；细胞因子

中药蛇六谷，又名魔芋，为天南星科魔芋属（Amorphophallus）多年生草本植物的块茎，据《中药大辞典》中记载：本品性寒味辛，有毒，内服有化痰消积、解毒散结、行瘀止痛的功效[1]，为江浙一带临床常用的抗肿瘤中药[2]。魔芋葡甘露聚糖（konjacmannan，KGM）是蛇六谷主要有效成分，也是其发挥抗肿瘤作用的主要成分之一[3]。本实验以Lewis肺癌移植瘤C57BL/6小鼠为模型，观察魔芋葡甘露聚糖对小鼠免疫功能的影响，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级近交C57BL/6纯系小鼠50只，Lewis荷瘤小鼠4只，雄性，6～8周龄，体质量16～20g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。动物合格证号：SCXK：（沪）2013-0016，饲养于浙江中医药大学动物实验中心SPF级动物房。

1.2 药物与试剂 魔芋葡甘露聚糖：成都市圣特蒙魔芋微粉有限责任公司，纯度＞90%，批号140305。环磷酰胺（CTX）：山西普德药业股份有限公司生产，规格：0.2g/瓶，批号04141103。RPMI-1640、DMEM培养基、胎牛血清：美国Gibco公司。PBS（磷酸盐缓冲液）：吉诺生物医药技术有限公司。

1.3 造模及分组方法 在无菌条件下，颈椎脱臼法处死4只Lewis肺癌荷瘤小鼠，剖取生长良好的新鲜肿瘤组织，剔除纤维包膜和坏死组织，剪碎，匀浆，过滤制成瘤细胞悬液，调整细胞浓度为1×107/mL，接种于50只C57BL/6小鼠右腋窝皮下，每只接种0.2mL（含瘤细胞数2×104个），30min内完成。随机分为KGM高、中、低剂量组、对照组、CTX组，每组10只。

1.4 给药方法 建模第2天起，KGM高、中、低剂量按300mg/（kg·d）、200mg/（kg·d）、100mg/（kg·d）连续灌胃13天，对照组以等剂量生理盐水灌胃13天，环磷酰胺组按30mg/kg腹腔注射给药每周2次，共4次。

1.5 取材及标本处理 颈椎脱臼处死小鼠，放入75%的酒精中浸泡3min。在超净工作台上剥离瘤体，迅速称重并记录，使用10%中性甲醛溶液保存。无菌取出脾脏，称重并记录脾重。无菌小镊子撕碎脾组织，过滤，离心后弃上清，加入红细胞裂解液，重悬，室温破红5min，离心后弃红细胞裂解液，加入PBS重悬，离心洗涤后用含有血清的1640培养基重悬，待计数，加药铺板。计数每组细胞，每组分别取1×107个细胞，以每孔100μL铺96孔板，每样4个复孔。因有灌胃不当导致小鼠死亡10只，最后每组取8只小鼠标本检测。

1.6 主要检测指标测定 抑瘤率（%）=（对照组瘤重平均值-用药组瘤重平均值）/对照组瘤重平均值× 100%；脾脏指数=脾质量（mg）/体质量（g）×10；参照试剂盒，MTS法测定脾脏T淋巴细胞增殖反应；参照试剂盒方法，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脾细胞中IL-2表达。

1.7 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料以（±s） 表示，采用独立样本t检验，率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 魔芋葡甘露聚糖对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长的影响 与对照组比较，各组瘤重均降低，其中CTX组、KGM中剂量组、KGM高剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）；KGM低、中、高剂量组瘤重高于CTX组，差异有统计学意义（P＜0.05）；KGM高、中、低剂量组，抑瘤率逐渐减低，两两比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组小鼠瘤重和抑瘤率比较（±s）

表1 各组小鼠瘤重和抑瘤率比较（±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05；与CTX组比较，▲P＜0.05；KGM：魔芋葡甘露聚糖；CTX：环磷酰胺

鼠数组别对照组CTX组KGM低剂量组KGM中剂量组KGM高剂量组8 8 8 8 8瘤重（g）2.51±1.11▲0.69±0.50△2.15±0.88▲1.71±0.95△▲1.54±0.83△▲抑瘤率（%）-72.56 14.27 31.92 38.59

2.2 魔芋葡甘露聚糖对Lewis肺癌小鼠脾脏指数的影响 与对照组比较，CTX组脾脏指数降低，差异有统计学意义（P＜0.05），KGM低、中、高剂量组脾脏指数升高，其中KGM中、高剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）；与CTX组比较，中药各剂量组脾脏指数均升高，且差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠脾脏指数比较（mg/g，±s）

表2 各组小鼠脾脏指数比较（mg/g，±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05；与CTX组比较，▲P＜0.05；KGM：魔芋葡甘露聚糖；CTX：环磷酰胺

组别对照组CTX组KGM低剂量组KGM中剂量组KGM高剂量组鼠数8 8 8 8 8脾脏指数4.61±0.69▲2.73±1.19△5.52±1.21▲5.93±0.88△▲6.02±1.47△▲

2.3 魔芋葡甘露聚糖对Lewis肺癌小鼠脾脏T细胞增殖反应的影响 与对照组比较，CTX组T淋巴细胞增殖反应能力下降（P＜0.05），KGM低、中、高剂量组T淋巴细胞增殖反应能力增强，其中KGM高剂量组最强（P＜0.05）；与CTX组相比，KGM低、中、高剂量组的T淋巴细胞增殖反应能力均增强（P＜0.05），见表3。

表3 各组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应比较（±s）

表3 各组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应比较（±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05；与CTX组比较，▲P＜0.05；KGM：魔芋葡甘露聚糖；CTX：环磷酰胺

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2.4 魔芋葡甘露聚糖对Lewis肺癌小鼠脾细胞IL-2反应的影响 ELISA结果显示，与对照组比较，CTX 组IL-2下降（P＜0.05），中药各剂量组上升（P＜0.05），且中药各剂量组两两比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表4。

表4KGM对Lewis肺癌小鼠脾细胞IL-2的影响（pg/mL±s）

表4KGM对Lewis肺癌小鼠脾细胞IL-2的影响（pg/mL±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05；与CTX组比较，▲P＜0.05；中药各剂量组两两比较，*P＜0.01；KGM：魔芋葡甘露聚糖；CTX：环磷酰胺；IL-2：白细胞介素-2

组别对照组CTX组KGM低剂量组KGM中剂量组KGM高剂量组鼠数8 8 8 8 8 IL-2 552.98±27.99▲434.43±44.64△664.69±30.46△*▲830.83±71.42△*▲1058.47±70.58△*▲

3 讨论

研究[3]显示，蛇六谷中含50%～60%的魔芋葡甘露聚糖（KGM），KGM是其主要的有效成分，也是发挥抗肿瘤作用的主要成分之一。自上世纪八十年代有研究[3]表明KGM具有抑制小鼠自发性肝肿瘤和大鼠诱发性结肠癌作用以来，对于KGM抗肿瘤作用及其机理研究不断拓展。Wu等[4]用5%～10%KGM饲料喂饲小鼠25周能使肿瘤发生率从100.0%下降至50.0%，表明KGM具有显著的预防肿瘤作用。王玲等[5]报道魔芋精粉（含KGM88.9%）在二甲肼诱发大鼠肠癌中对粪中性类固醇排出的影响,在一定程度上证实了高KGM含量的魔芋精粉在摄入后相对稀释了肠道致癌原，降低大肠中致癌物浓度。

本实验结果显示，KGM各组与对照组比较，瘤重均降低，其中CTX组降低最明显，说明化疗药物抑制肿瘤的效果突出，KGM中、高剂量组瘤重也有明显降低（P＜0.05），表明KGM对Lewis肺癌生长起到一定的抑制作用。同时，与对照组相比，CTX组脾脏指数降低，KGM各组脾脏指数升高，显示KGM对Lewis肺癌小鼠免疫器官脾脏有一定的保护作用。

肿瘤能够在人体内发生并持续发展，是由于肿瘤细胞在长期的形成过程中，形成了多重免疫逃逸机制，躲避了免疫系统的监视，机体的免疫系统出现障碍，因此无法对肿瘤细胞进行识别和杀伤[6-8]。抗肿瘤免疫效应可分为细胞免疫和体液免疫，而细胞免疫占主导地位。细胞免疫应答主要是T细胞介导的特异性细胞免疫，已证明T细胞具有有效的抗肿瘤作用[9]。IL-2是免疫系统的重要因子，是保障机体正常免疫功能的关键因素。IL-2可激发免疫效应器细胞，产生各种继发的细胞因子，如γ-干扰素（IFNγ）和肿瘤坏死因子（TNF）等。IL-2是机体最主要、最强有力的T细胞生长因子，能刺激T细胞进入细胞分裂周期，增强T细胞的杀伤活性，更有效的诱导抗肿瘤免疫[10]。本实验显示，KGM各组T淋巴细胞增殖反应增强（P＜0.05），提示KGM可促进小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖，可能增强荷瘤小鼠T细胞介导的细胞免疫功能。T淋巴细胞按照功能和表面标志可以分成很多种类，因实验条件和标本受限，本实验未进一步分离检测T淋巴细胞亚群，即CD4+、CD8+、CD25+T细胞增殖活力情况，因此，KGM调节小鼠脾脏T细胞增殖的机理值得继续研究。与CTX组比较，KGM各剂量组IL-2水平显著提高，提示KGM治疗后小鼠的细胞免疫功能得到增强（P＜0.05），KGM能上调IL-2，这可能是其促进T淋巴细胞增殖的一个重要机制之一，同时也可能是其抗肿瘤作用的机制之一。

本研究仅对KGM抑制肿瘤生长和对免疫调节作用进行了初步探讨，关于KGM抗肿瘤的机制可能还有很多，如诱导细胞分化、凋亡、抑制肿瘤新生血管形成、抗氧化等，具体机制有待进一步研究。

［1］南京中医药大学.中药大辞典［M］.第2版.上海：上海科学技术出版社，2006：3855.

［2］《浙江药用植物志》编写组.浙江药用植物志（下册）［M］.杭州：浙江科学技术出版社，1980：1475-1479.

［3］刘红.魔芋的药用研究进展［J］.湖北民族学院学报，2002，19（3）：35-37.

［4］Wu WT，Chen HL.Effects of konjac glucomannan on putative risk factors for colon carcinogenesis in rats fed a high-fat diet［J］.Agric Food Chem，2011，59（3）：989-994.

［5］王玲，王国燕，邓学瑞，等.魔芋精粉对小鼠免疫器官和细胞因子水平的影响［J］.云南大学学报，1998，20（2）：139-141.

［6］Karanika S，Karantanos T，Theodoropoulos GE.Immune response after laparoscopic colectomy for cancer：a review［J］. Gastroenterol Rep，2013，9（2）：85-94.

［7］Smyth MJ，Hayakawa Y，Takeda K，et al.New aspects of natural-killer-cell surveillance and therapy of cancer［J］.Nature reviews Cancer，2002，2（11）：850-861.

［8］Robertson FC，Berzofsky JA，Terabe M.NKT cell networks in the regulation of tumor immunity［J］.Front Immunol，2014，28（5）：543.

［9］Schmidt A，Oberle N，Weiss EM，et al.Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca（2+），NF-κB，and NFAT signaling in conventional T cells［J］.Sci Signal，2011，20（4）：90-97.

［10］Boyman O，Kolios AG，Raeber ME.Modulation of T cell responses by IL-2 and IL-2 complexes［J］.Clin Exp Rheumatol，2015，33（4 Suppl 92）：54-57.

（收稿：2015-12-09 修回：2016-01-22）

Effect of Konjac Glucomannan on Immune Function in Lewis Lung Cancer Cell Transplanted Mice

PAN Lei1,ZHOU Fei2,CHEN Peifeng1. 1 Department of Oncology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China;2 Department of Oncology,the First People's Hospital of Xiaoshan Distict,Hangzhou(311200),China

ObjectiveTo investigate the effect of the traditional Chinese medicine Rhizoma amorphophalli extract-konjac glucomannan（KGM）on immune function in rats with Lewis lung cancer.Methods Lewis lung cancer transplanted mice were established,then randomly assigned to 5 groups：KGM high-dose group,KGM middle-dose group,KGM low-dose group,control group and cyclophosphamide（CTX）group.From day 2 after modeling,rats in KGM high-,middle-,and low-dose groups were intragastrically treated with 300mg/kg，200 mg/kg,and 100mg/kg of KGM once daily for 13 d.Control group was given equivalent volume of saline for the same period of time. CTX Group was treated with CTX 30mg/kg,intraperitoneally 2 times weekly,in a total of 4 times.The mice were sacrificed on day 14 to weigh the neoplasms and spleen and calculate the inhibition rate of tumor,spleen index. MTS method was used to detect the splenic T lymphocyte proliferation vitality,ELISA method was used to detect the expression of IL-2 in splenic cells.ResultsCompared with control group,the tumor weight in CTX group,KGM middle-and high-dose groups were significantly lower（0.69±0.5g,1.71±0.95g,1.54±0.83g vs 2.51±1.11g,P＜0.05）;but the tumor weight in KGM low-（2.15±0.88g）,middle-,and high-dose groups were higher than that in CTX group（P＜0.05）.Compared with control group,CTX group had decreased spleen index（2.73±1.19mg/g vs 4.61± 0.69mg/g,P＜0.01）,all KGM groups had increased spleen index,but only that in the middle-and high-dose groups with a statistically significant difference（5.93±0.88mg/g,6.02±1.47mg/g vs 4.61±0.69mg/g,P＜0.01）.Compared with control group,the T-lymphocytes proliferation response ability in CTX group was decreased（0.4055±0.2295 vs 0.6125±0.0719,P＜0.05）,that in all KGM groups were enhanced,with the strongest in KGM high-dose group （0.8198±0.0251 vs 0.6125±0.071,P＜0.05）;the T-lymphocytes proliferation response ability in all KGM groups were higher than that in CTX group（0.6338±0.1027,0.7000±0.0966,0.8198±0.0251 vs 0.4055±0.2295,P＜0.05）. Compared with control group,CTX group had reduced IL-2（434.43±44.64pg/mL vs 552.98±27.99pg/mL,P＜0.01）, KGM high-,middle-,and low-dose groups had elevated IL-2（664.69±30.46pg/mL,830.83±71.42pg/mL,1058.47± 70.58pg/mL vs 552.98±27.99pg/mL,P＜0.01);a significant difference was noted between KGM groups（P＜0.01）.ConclusionKGM can inhibit the growth of Lewis lung cancer in mice by improving immune function through enhancing splenic T-lymphocyte proliferation and raising the expression of IL-2.

mice;Lewis lung cancer;konjac glucomannan;T-lymphocyte;cytokine

浙江省自然科学基金项目（No.LY13H290012）

1浙江中医药大学附属第一医院肿瘤科（杭州 310006）；2杭州市萧山区第一人民医院肿瘤科（杭州 311200）

陈培丰，Tel：0571-87072196；E-mial：CPF12345@163.com