2型糖尿病肾病CX3CR1基因多态性相关因素及中医证型分析

朱阿楠方亚君许 红王利峰陈洪宇俞艳雯

·论著·

2型糖尿病肾病CX3CR1基因多态性相关因素及中医证型分析

朱阿楠1方亚君1许 红1王利峰1陈洪宇2俞艳雯1

目的探讨糖尿病肾病（DN）患者CX3CR1-V249I基因突变与中医证型、尿微量白蛋白与肌酐比值（ACR）及炎症因子之间的关系。方法应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性的方法及反向测序法检测108例DN患者CX3CR1-V249I多态性情况，同时测定DN患者血浆同型半胱氨酸（Hcy）、糖化血红蛋白（HbA1c）、ACR、低密度脂蛋白（LDL）、核因子-κB（NF-κB）、白介素-6 （IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、趋化因子Fractalkine（FKN）含量，并记录患者的中医证型。结果108例DN患者中CX3CR1基因VV型87例，Ⅵ型17例，Ⅱ型4例。中医证型与CX3CR1-V249I基因型之间具有相关性（χ2=10.136，P＜0.05），VV型基因多辨证为气阴两虚型，Ⅵ和Ⅱ型以阴虚燥热为主。与阴虚燥热型和阴阳两虚型比较，气阴两虚型患者具有更高的ACR水平[（948.3±36.4）mg/g比（919.3±31.5）mg/g、（921.8±37.9）mg/g，F=4.946，P＜0.05]；与痰湿证、湿热证比较，兼血瘀证患者具有更高的ACR水平 [（954.3±34.3）mg/g比（921.5±36.9）mg/g、（917.8±37.1）mg/g，F=7.283，P＜0.05]。CX3CR1-V249I基因突变与Hcy、ACR水平相关（t=3.601、2.692，P均＜0.05）。且V249I野生型（VV型）患者较突变型（Ⅵ型+Ⅱ型）患者NF-Kb[（0.94±0.16）ng/mL比（0.75±0.17）ng/mL，t=7.926，P＜0.05]、IL-6[（170.75±34.01）pg/mL比（147.43±27.23）pg/mL，t=5.472，P＜0.05]、TNF-α[（95.91±19.21）ng/mL比（81.12±13.50）ng/mL，t=2.887，P＜0.05]含量要高，FKN则在突变型患者表达更多 [（1.10± 0.19）ng/mL比（0.83±0.12）ng/mL，t=9.246，P＜0.05）。结论DN患者CX3CR1-V249I基因多态性与Hcy、ACR、NF-κB、IL-6、TNF-α、FKN及中医证候相关。

糖尿病肾病；中医证候；CX3CR1；尿微量白蛋白/肌酐比值；同型半胱氨酸；炎症介质

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病引起的最严重、危害性最大的一种慢性并发症，病变特点是微血管病变导致的肾小球硬化。CX3CR1是趋化因子（fractalkine，FKN）的高选择性受体，参与了白细胞黏附和聚集以及迁移,在血管内皮的炎性损伤中起重要作用。CX3CR1-V249I基因突变可能对这一过程产生影响。本课题研究CX3CR1基因多态性和中医证型、尿微量白蛋白与肌酐比值（albumin to creatinine ratio，ACR）及炎症因子之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2009年1月—2013年12月本院门诊或住院2型DN患者108例，男70例，女38例，平均年龄（60.15±10.21）岁，平均糖尿病病程（9.0±2.42）年。所有病例诊断符合中国2型糖尿病防治指南（2007年版）糖尿病肾病诊断标准[2]，要求3～6个月内至少出现2次ACR异常，ACR＞300mg/g诊断为大量白蛋白尿；ACR 30～300mg/g为微量白蛋白尿。中医辨证分型标准参照《中药新药临床研究指导原则》[3]分为阴虚热盛、气阴两虚、阴阳两虚，兼证分为痰湿证、血瘀证、湿热证。排除原发性肾脏疾病患者；严重的心血管与肝脏疾病患者；30岁以下；合并感染或发热患者；肿瘤患者。所有受试者均签署知情同意书。

1.2 临床生化指标及炎症因子检测方法 所有受检者过夜禁食12h后，于晨起空腹采集肘静脉血，应用自动生化分析仪检测低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）、肾功能；应用美国伯乐公司高压液相自动测定仪测定糖化血红蛋白（HbA1c）。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定（酶标仪型号：DENLEY DRAGON Wellscan MK 3；产地：芬兰Thermo公司）血清FKN、核因子-κb、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度。留取晨尿，应用日立生化分析仪，采用肌酐酶法检测尿肌酐；应用西门子BN-2全自动免疫分析仪，采用散射比浊法检测尿微量白蛋白，测量2次尿微量清蛋白与尿肌酐，取两次测量ACR平均值，ACR=尿微量白蛋白/尿肌酐×88 400，单位是mg/g[2]。

1.3 人外周血全血基因组DNA提取及CX3CR1基因多态性分析 每样本（空腹肘静脉血，EDTA-K2抗凝，-70℃低温冰箱保存）取300μL全血，利用杭州艾迪康医学研究中心提供的外周血DNA提取试剂盒提取基因组DNA，DNA浓度为50～150ng/μL。引物由杭州艾迪康医学研究中心合成：上游引物：5’TCAT CCAGACGCTGTTTTCC-3’，下游引物：5’-GGCATTT CCCATACAGGTG-3’。PCR产物经测序（测序过程及测序图略），总长为588bp。NCBI上进行BLAST，确认为目的基因，符合研究设计。使用限制性内切酶AclⅠ对V249I酶切位点进行酶切。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件包进行统计分析，等位基因频率比较采用R×C列联表χ2检验，计量资料两组间均数比较采用t检验，多组间指标均值比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CX3CR1基因V249I酶切结果 V249I多态位点中，显示仅1条条带（295bp），为突变型纯合子Ⅱ型（4例），显示2条条带（104bp、191bp），为野生型纯合子VV型（87例），显示3条条带（104bp、191bp和295bp），为杂合子Ⅵ型（17例）（图1，见插页）。

2.2 中医证型与基因型相关性分析 糖尿病肾病的中医证型与CX3CR1-V249I基因型之间具有相关性（χ2=10.136，P＜0.05），VV型基因多辨证为气阴两虚型，Ⅵ和Ⅱ型以阴虚燥热为主，见表1。中医兼证证型与CX3CR1-V249I基因型之间也具有相关性（χ2= 13.909，P＜0.01），VV型以血瘀证最多，VI和Ⅱ型以痰湿证为主，见表2。

表1 糖尿病肾病患者中医证候与基因型的相关性[例（%）]

表2 糖尿病肾病患者中医兼证与基因型的相关性[例（%）]

2.3 CX3CR1-V249I各基因型的相关因素分析V249I野生型（VV型）和突变型（因纯和突变例数较少，故将Ⅵ+Ⅱ合为突变型）患者平均动脉血压、血肌酐、低密度脂蛋白及糖化血红蛋白含量比较无明显差异（P＞0.05）。野生型患者较突变型患者ACR、Hcy、NF-κB、IL-6、TNF-α含量增高，FKN则在突变型患者表达更多（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

表3 糖尿病肾病患者各基因型相关因素分析

2.4 不同中医证型糖尿病肾病患者ACR比较 各中医证型组间ACR比较，差异有统计学意义（F= 4.946，P＜0.01），气阴两虚型患者ACR值明显较其他两组升高。兼血瘀证患者较非血瘀证患者具有更高的ACR水平，差异有统计学意义（F=7.283，P＜0.01），见表4。

3 讨 论

糖尿病肾病乃本虚标实之证，本虚有“气阴两虚”、“阴虚”、“（气）阳虚”、“阴阳两虚”等虚证。标实有血瘀、湿浊、燥热等实证[4]。本文采用的“三型辨证”理论体系依据为卫生部制定《中药新药临床研究指导原则》。本研究中108例患者中气阴两虚共54例，占50.0%，血瘀证在兼证中占46.3%，因此，气阴两虚兼血瘀可能为DN的主要病机。

多数学者[5-6]认为，DN的基本病机演变为阴虚燥热—气阴两虚—阴阳两虚，其中气阴两虚阶段的持续时间较长，为影响疾病转归之枢纽，而血瘀兼证是导致病情迁延进展的重要因素。本研究通过分析DN患者CX3CR1-V249I基因型与中医证候之间的关系发现，野生型主证以气阴两虚分布比例最高，Ⅵ和Ⅱ型以阴虚燥热为主。兼证中,野生型以血瘀证最多，Ⅵ和Ⅱ型以痰湿为主。且气阴两虚、兼血瘀证患者ACR较其他两型明显增高（P＜0.01）。说明野生型患者可能更易发生肾脏损害。CX3CR1-V249I位于CX3CR1第6跨膜区，等位基因突变的结果是异亮氨酸在密码子249处替代了缬氨酸。本课题组既往研究[7]发现，CX3CR1基因的249I等位基因与DN发生的危险性下降明显相关，独立于DN其他危险因素。因此，对于野生型、气阴两虚、兼血瘀证患者，及早予以中医辨证施治有着积极的作用。

ACR是判断2型糖尿病进展为DN的重要指标，且与肾脏病变严重程度有密切关系[1]，且利用尿肌酐矫正的办法使随机尿微量白蛋白的结果稳定可靠。Hcy是蛋氨酸循环中的重要产物，可直接损伤血管内皮细胞，还可促血小板凝聚、脂蛋白氧化和平滑肌增生、加速血管病变[7]。研究[8-9]发现，血清Hcy水平越高，周围血管病变的程度愈加严重，且高Hcy血症被认为是血管性疾病的独立危险因素。本研究发现，V249I野生型患者较突变型患者ACR、Hcy含量高。这一结果说明野生型患者更易出现肾脏血管病变及蛋白漏出，加速DN的发生发展。有研究[10]发现，LDL可以刺激单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的表达，引起单核-巨噬细胞趋化，促进肾小球动脉硬化的发展。但本研究中野生型患者和突变型患者LDL水平无差异（P＞0.05），也可能其引起肾脏损伤的机制与FKNCX3CR1系统关系不大，有待进一步研究。

表4 糖尿病肾病患者中医证候与基因型的相关性

CX3CR1是G-蛋白偶联受体，趋化因子FKN与CX3CR1结合以后，启动细胞内信号传导机制并形成级联反应，促进单核细胞表达TNF-α和NF-κB，从而产生相应的生物学效应[11]。本研究发现，V249I野生型患者较突变型患者NF-κB、IL-6、TNF-α含量高，FKN则在突变型患者表达更多。虽然突变型患者FKN含量较高，但CX3CR1-V249I变异型对FKN的趋化活性下降，与FKN的结合率也降低[12]。而DN患者CX3CR1-V249I野生型相对变异型而言，CX3CR1表达增加，对FKN的趋化活性增强，FKN-CX3CR1系统激活，单核细胞表达NF-κB和TNF-α增加，肾血管内皮细胞和系膜细胞的损伤，促进DN的发生发展；NF-κB的增加促使血清IL-6升高并刺激肾小球系膜增殖、细胞外基质的产生，使肾小球滤过膜增厚[13]，加速DN的病情进展。

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（收稿2015-06-09 修回2015-10-28）

Relationship Between the Correlated Factors of CX3CR1 Mutations and the Different TCM Syndromes inType-2 Diabetic Nephropathy

RZHU A'nan1,FANG Yajun1,XU Hong1,WANG Lifeng1,CHEN Hongyu2,YU Yanwen1. 1 Department of Internal Medicine,Yuyao Traditional Chinese Medicine Hospital,Yuyao(315400),China; 2 Department of Nephrology,Hangzhou Traditional Chinese Medicine Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo explore the relationship between CX3CR1-V249I mutation and the different syndromes of TCM,albumin to creatinine ratio（ACR）and inflammatory cytokines in patients with type-2 diabetic nephropathy （DN）.MethodsBy polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）and re verse sequencing method,CX3CR1-V249I gene polymorphism was analyzed in 108 patients with DN.The levels of homocysteine（Hcy）,glycosy lated hemoglobin（HbA1c）,ACR,low-density lipoprotein and the serum contents of NF-κb,IL-6,TNF-α,and FKN were detected.The TCM syndromes of DN in patients were recorded.ResultsOut of 108 patients,87 had VV wild genotype and 21 had non-wild genotype including 17 of VI genotype and 4 of homozygote（II genotype）.The CX3CR1-V249I gene polymorphisms was related to the TCM syndromes of DN （χ2=10.136,P＜0.05）.Patients with genotype VV had mostly the syndrome of Qi and Yin deficiency,and patients with genotype VI+II had mostly the syndrome of Yin deficiency with heat.Patients with the syndrome of Qi and Yin deficiency had higher ACR level compared with patients with the syndrome of Yin deficiency with heat and the syndrome of Yin and Yang deficiency（948.3±36.4mg/g vs 919.3±31.5mg/g and 921.8±37.9mg/g;F=4.946,P＜0.05）;patients with the syndrome of Qi and Yin deficiency accompanying to blood stasis had higher ACR level compared with patients with the syndrome of Qi and Yin deficiency accompanying to phlegmatic hygrosis or dampheat constitution（954.3±34.3mg/g vs 921.5±36.9mg/g and 917.8±37.1mg/g;F=7.283,P＜0.05）.CX3CR1-V249I mutation was related with serum Hcy level and ACR level（t=3.601,2.692,P＜0.05）.The serum contents of NF-κB, IL-6,and TNF-α were increased significantly in the patients with VV genotype than those with VI+II genotypes （NF-κB：0.94±0.16ng/mL vs 0.75±0.17ng/mL,t=7.926,P＜0.05;IL-6：170.75±34.01pg/ml vs 147.43±27.23pg/ml,t= 5.472,P＜0.05;TNF-α：95.91±19.21ng/mL vs 81.12±13.50ng/mL,t=2.887,P＜0.05）,but FKN was lower（0.83± 0.12ng/mL vs 1.10±0.19ng/mL,t=9.246,P＜0.05）.ConclusionThe CX3CR1 polymorphism in patient of type-2 DN was related with serum Hcy,ACR,NF-κB,IL-6,TNF-α,and FKN and TCM syndromes.

diabetic nephropathy;TCM syndrome;CX3CR1;urinary albumin to creatinine ratio;homocysteine; mediators of inflammation

浙江省余姚市科技局项目（No.2009Y11）

1浙江省余姚市中医院内科（朱阿楠）、肾内科（方亚君、许红、王利峰、俞艳雯）（余姚 315400）；2杭州市中医院肾内科（杭州 310006）

朱阿楠，Tel：0574-62674919；E-mail：yylinyanrong@163.com