维生素E对4℃保存藏猪精液品质和抗氧化保护作用的影响

陈晓英，马金英，宋天增，唐建华，赵彦玲，任子利，朱彦宾，王良润

（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009；2.西藏自治区畜牧总站，拉萨 850000；3.西藏农牧学院动物科学学院，林芝 860000；4.西藏牧乐农业科技有限公司，拉萨 850009）

维生素E对4℃保存藏猪精液品质和抗氧化保护作用的影响

陈晓英1，马金英1，宋天增1，唐建华2，赵彦玲3，任子利3，朱彦宾1，王良润4

（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009；2.西藏自治区畜牧总站，拉萨 850000；3.西藏农牧学院动物科学学院，林芝 860000；4.西藏牧乐农业科技有限公司，拉萨 850009）

试验旨在研究维生素E对4℃藏猪精液品质和抗氧化保护作用影响，采用电刺激法采集健康藏猪精液，在改进的猪精液低温稀释液为基础液中，每1 000 mL添加维生素E 0、3.0、4.0、5.0、6.0 g，将藏猪种公猪新鲜精液做4倍稀释后于4℃环境保存至第5天，以藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率为评价精液品质指标，以超氧化物歧化酶（Superoxidas dismutase,SOD）活力和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量为评价抗氧化保护作用指标，探讨维生素E对4℃藏猪精液品质影响。结果显示：维生素E 5.0 g/L添加组藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率均极显著好于其他试验组（P＜0.01）。精浆超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量以5.0 g/L维生素E添加组为最高；同时发现，5.0 g/L维生素E添加组精子超氧化物歧化酶活力与其他各组间差异不显著。总之，在改进的猪精液稀释液中添加5.0 g/L的维生素E可明显改善4℃环境保存藏猪精液品质和抗氧化保护作用，此试验研究为今后藏猪精液低温保存的生产应用奠定了基础。

维生素E；藏猪；4℃环境；精液品质；抗氧化保护

藏猪主要分布于雅鲁藏布江流域中游河谷区和藏东三江流域中游海拔为3 500 m左右的气候条件恶劣的高原地带，是我国唯一的高原猪种[1-2]。藏猪具有肉质优良、耐严寒、耐粗饲、抗逆性强等优点。为降低养猪成本，可用藏猪在抗病性和适应性等方面优良的遗传特性改良外种猪及其他地方猪的遗传结构[3]。

猪精液保存技术推广应用的重要性在于通过扩大精液使用的时间和地域范围，提高优秀种公猪的利用效率，从而降低公猪饲养成本，加速猪的遗传改良，避免通过交配传播疾病，同时也在猪品种资源和原始资源及基因库种质资源保存等方面起重要作用。猪精液的保存有液态保存和冷冻保存两种，目前在生产实践中应用的仍为液态保存中的常温[4]或冷藏保存。冷冻可长期保存猪的精液，但因解冻后人工授精的受胎率很低[5]而无法推广应用。公猪精液的低温保存不如常温保存效果好，公猪精液常温保存在生产上具有较大的实用价值。常温保存人工授精的效果好，且方便经济，但受到保存时间的限制[6-9]，随着保存时间的延长公猪精液会引发脂质过氧化，超氧化物歧化酶（Superoxidas dismutase,SOD）活力下降和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量降低[10-11]，最终引发脂质过氧化，降低线粒体膜电位，提高等离子体膜透性，最终影响受胎率。而维生素E是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一，不易被酸、碱及热所破坏，但却极易被氧化。维生素E对线粒体、网状组织或浆膜的磷脂有着特殊的亲和性，存在于这些膜的特定部位。维生素E是重要的抗氧化剂，能通过抑制自由基的形成，阻止诱发的膜脂质发生过氧化，从而维持精子顶体膜的完整，提高精子顶体完整率和降低精子畸形率[12-13]。

4℃低温保存，精子代谢活动水平低，脂质过氧化程度低，保存时间比常温更长，同时可应用普通冰箱保存，经济方便[14]。随着现代化藏猪养殖生产技术的提高，为有效控制疫病传播、降低饲养公猪的费用、提高猪群品质，解决藏猪精液的妥善保存问题，人工授精技术服务于藏猪产业发展已迫在眉睫。任子利等[14]研究了维生素C对藏猪精液4℃保存及其精子全基因组DNA甲基化的影响。本研究拟在任子利等[14]研究的基础上，在改进的猪精液低温稀释液为基础液中，每1 000 mL添加维生素E 0、3.0、4.0、5.0、6.0 g，将藏猪种公猪新鲜精液做4倍稀释后于4℃环境保存至第5天，以藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率为评价精液品质指标，以SOD活性和MDA含量为评价抗氧化保护作用指标，探讨维生素E对4℃藏猪精液品质的影响。以期为藏猪精液低温保存的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物与材料

1.1.1 试验动物与试验地点 试验藏猪为3～5岁健康种公猪6头。试验时间为2015年5—7月，试验地点为西藏工布江达县错高乡某藏猪养殖专业合作社、西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所和西藏大学农牧学院动物科学学院。

1.1.2 主要设备与试剂 动物电刺激采精仪（MDW-1，成都华智开物科技有限公司），倒置荧光显微镜（IX73，奥林巴斯），电热恒温水槽（DKB-450A，上海森信），变频冰箱（BCD-649WDVC，海尔），-80℃冰箱（MDF-U33V，合肥荣事达三洋电器股份有限公司）。

维生素E（宜昌人福药业有限责任公司）、考马斯亮蓝（国药集团化学试剂有限公司）、Diff-Quik Stain染液（北京普博斯）、亚卫精液稀释粉（丹麦）、速眠新Ⅱ（吉林省敦化市圣达动物药品有限公司）、SOD试剂盒和MDA测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

新鲜藏猪精液由西藏工布江达县错高乡某藏猪养殖专业合作社提供。

1.2 试验方法

1.2.1 改进的低温稀释液配制 参照孙时军等[15]的试验结果，使用亚卫牌精液稀释剂作为基础稀释剂，在稀释后的精液中加入1%乙二醇作为低温保护剂。

1.2.2 精液采集及处理 采用速眠新Ⅱ（0.1 mL/kg）肌内注射麻醉健康藏猪种公猪，用动物电刺激采精仪于3 V、50 mA条件下电刺激法采集健康藏猪精液。

将藏猪精液（精子活力0.8以上）做4倍稀释，用6层以上纱布包裹后放入培养箱中，17℃平衡2 h后，放入冰箱4℃保存。

1.2.3 精子质量评价 精子活力和精子畸形率两项精液常规性状参照世界卫生组织标准（WHO）[16]的方法测定，具体方法如下。

精子活力：精液过滤后立即在显微镜下观察精子活力，采用百分制法，直线前进精子数占总精子数的百分比为精子活力。

精子畸形率：采用龙胆紫酒精溶液染色法，将精子涂片染色，在400倍显微镜下观察，计算不同视野500个精子中畸形精子占比例即为畸形率（取3次计算的平均值）。

精子顶体完整率和精子质膜完整率两项精液性状参照文献[17]进行评价。精子顶体完整率：考马斯亮蓝R250染色法。精子质膜完整率：低渗肿胀试验—HOST。

1.2.4 精液抗氧化指标的测定 超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量的测定，使用SOD试剂盒和MDA测定试剂盒，采用比色法测定精浆和精子中总SOD的活性及MDA含量。具体方法参照文献[18]进行。

1.3 试验设计

1.3.1 维生素E对4℃保存藏猪精液品质的影响试验分5组，在改进的猪精液低温稀释液为基础液中，每1 000 mL添加维生素E 0、3.0、4.0、5.0、6.0 g，将藏猪种公猪新鲜精液做4倍稀释后于4℃保存到第5天时以藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率为评价指标，探讨维生素E对4℃保存藏猪精液品质的影响。试验重复3次。

1.3.2 维生素E对4℃保存藏猪精液抗氧化保护作用的影响 试验分组同1.3.1。每次采精后收集精液，取10 mL鲜精液于玻璃离心管中，在4 000 r/min离心分离15 min，取精浆分装于2 mL塑料离心管，置-80℃冰箱保存备用，用于精浆生化参数及抗氧化指标的测定。试验重复3次。

1.4 数据处理

所得试验数据用Excel进行前期处理，再用SPSS 11.5软件进行One-Way ANOVA方差分析，并进行多重比较，试验结果用平均数±标准差表示，检验误差为5%和1%。

2 结果与分析

2.1 维生素E对4℃保存藏猪精液品质的影响

由表1可以看出，藏猪精液4℃保存到第5天时，5.0 g/L维生素E添加组的精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率这4个指标均极显著好于其他组（P＜0.01）。

表1 维生素E对4℃保存藏猪精液品质的影响（n=18）

2.2 维生素E对4℃保存藏猪精液抗氧化保护作用的影响

由表2可以看出，藏猪精液4℃保存到第5天时，精浆超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量以5.0 g/L维生素E添加组为最高；同时发现，5.0 g/L维生素E添加组精子超氧化物歧化酶活力与其他各组间差异不显著；精子MDA含量以5.0 g/L维生素E添加组为最高，与3.0 g/L组差异极显著（P＜0.01），与4.0、6.0 g/L组差异显著（P＜0.05）。

表2 维生素E对4℃保存藏猪精液抗氧化保护作用的影响（n=18）

3 讨论

3.1 维生素E对4℃保存藏猪精液品质的影响

维生素E能控制磷脂裂解生成二十碳四烯酸需要的磷酸酯酶A2的活性，二十碳四烯酸是所有前列腺素（prostaglandin,PG）的前体，间接影响PG的合成。精液稀释后，PG的含量会有所下降和损失，添加维生素E可以起到弥补作用[19]，维持精子顶体膜的完整，提高精子顶体完整率和降低精子畸形率[12]。

本研究5.0 g/L维生素E添加量对高海拔地区藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率为优，高于何兰花等[20]在低海拔地区研究添加维生素E对猪精液保存的量3.5 g，但差距不大。这可能与生存环境的海拔区别引起的一系列生理生化指标的变化有关。

3.2 维生素E对4℃保存藏猪精液抗氧化保护作用的影响

维生素E被认为是精子抗氧化系统中最基本的组成成分，同时也是针对精液中氧自由基（ROS）和脂质过氧化的一种主要的膜保护物质，它是通过终止生物膜和膜蛋白的脂质过氧化反应链起作用。维生素E能通过抑制自由基的形成，阻止诱发的膜脂质发生过氧化[12]与本试验研究在猪精液低温稀释液中添加维生素E可提高精浆超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量一致。

本试验研究发现，在猪精液低温稀释液中添加维生素E，精子超氧化物歧化酶活力有所提高，但差异不显著。与有关研究报道在饲粮中添加维生素E对精子的抗氧化能力影响不大一致。

4 结论

本研究结果表明，在改进的猪精液稀释液中添加维生素E 5.0 g/L后将藏猪种公猪精液做4倍稀释，可以明显改善藏猪精液4℃保存的效果，同时可明显提高4℃保存对藏猪精液抗氧化保护作用。本试验研究将为藏猪精液低温保存的生产应用奠定基础。

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（编辑：郭玉翠）

手机玩得少，睡眠才能好

【英国《卫报》网站11月9日报道】研究人员告诫说，如果想晚上睡一个好觉，就别在睡前玩手机了。

美国的一项研究发现，睡眠模式被打乱，包括入睡时间加长，与盯着屏幕看的时间变长有关，尤其是在床上的时候。

研究报告的合著者、美国加利福尼亚大学旧金山分校的格雷戈里·马库斯说：“盯着屏幕的时间越长，睡眠质量越差。”

这一研究结果与越来越多表明使用电子设备会妨碍睡眠的证据相符。

英国萨里大学睡眠问题专家西蒙·阿彻说：“许多这类设备会发出蓝光，这种蓝光尤其成问题，因为它们抑制褪黑素。褪黑素在睡眠开始前的几小时开始上升，这是身体告诉你要准备睡觉了。”

阿彻说，蓝光对大脑也有一种警示作用，阅读文章或邮件会带来紧张情绪，而使用电子设备这种举动本身也发挥着一定作用。

来自加利福尼亚大学旧金山分校的研究人员在《科学公共图书馆·综合》期刊和心理保健应用程序上发表了这一研究结果。

在网上参与调查的人员被要求下载一个不断自动收集屏幕亮起时长的应用程序。该研究小组对使用该程序至少达到30天的人进行了分析。

共有653名成年人完成了调查，结果显示，参与者每小时花在智能手机上的时间平均为3.7分钟。更年轻的人，以及没有注明身份或者注明身份为“其他”的人，在手机上花费的时间更长。

进一步的分析表明，盯着屏幕的时间越长睡眠时间越短，而且在床上睡觉的时间越少。马库斯说，平均来看，每在手机上多花1分钟时间，睡觉时间约减少5分钟。

这项研究本身并没有表明是否盯着屏幕的时间加长导致睡眠质量下降，或者睡眠质量不佳的人最终会更频繁地使用手机。研究者表示，上网和使用脸书等应用程序对睡眠的影响效果还需要进一步研究。

（转自参考消息[N]，2016-11-11）

Effect of Vitamin E on Tibetan Boar Semen Preserved at 4℃ and Antioxidative

CHENXiaoying1,MAJinying1,SONGTianzeng1,TANGJianhua2,ZHAOYanling3,RENZili3,ZHUYanbin1,WANGLiangrun4
(1.Institute of Animal Science,Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Lhasa 850009, China;2.The Tibet Animal Husbandry Service,Lhasa 850000,China;3.Faculty of Animal Science,Tibet Agricultural and Animal Husbandry College,Nyingchi 860000,China;4.Tibet Mulo Agricultural Sciences and Technology Co.,Ltd.,Lhasa 850009,China)

This study was conducted to investigate the effects of vitamin E on Tibetan boar semen preserved at 4℃and antioxidative.The semen was collected from Tibetan boar by electrical stimulation.Add vitamin E 0 g, 3.0 g,4.0 g,5.0 g,6.0 g per 1 000 mL,in the improvement of pig semen low temperature dilution liquid.Save to fifth days at 4℃after dilution of fresh semen.Body integrity and membrane integrity rate of the top Tibetan pig sperm activity,sperm abnormal rate and semen quality evaluation index,to investigate the effect of vitamin E on the quality of semen quality at 4℃,the activity of Superoxidas dismutase(SOD)and Maleic dialdehyde(MDA) were the indexes to evaluate the protective effect of antioxidation.The results show that,The sperm motility, sperm deformity rate,sperm motility rate and plasma membrane integrity rate of the vitamin E 5 g/L addition group were significantly better than other test groups(P＜0.01),seminal plasma superoxide dismutase activity and MDA content was the highest in the 5 g/L vitamin E group.Also,at the same time,we found that,it was not significant difference between the other groups for sperm superoxide dismutase activity with 5 g/L vitamin E supplementation group.In short adding 5 g/L vitamin E to the improved pig semen diluent can significantly improve the semen quality and antioxidant protection at 4℃.The experimental study laid a foundation for the production and application of cryopreservation of boar semen in the future.

vitamin E;Tibetan pig;environmental science at 4℃;semen quality;antioxidant protection

S828

A

1002-1957(2016)06-0037-04

2016-10-05

西藏自治区2016年高校青年教师创新支持计划项目（NO.QCZ2016-47）；西藏自治区2016年农林业科技成果转化与推广（农牧业技术推广）项目“特色畜禽（藏猪）营养调控研究”

陈晓英（1981-），女，甘肃武威人，助理研究员，硕士，主要从事高原畜禽繁殖技术研究工作.E-mail：chenxiaoying0891@163.com

宋天增（1980-），男，助理研究员，硕士，研究方向为动物繁殖营养调控与遗传育种.E-mail：songtianzeng123@sina.com