半胱胺对4℃保存藏猪精液指标的影响

陈晓英，马金英，宋天增，唐建华，赵彦玲，任子利，朱彦宾，王良润

（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009；2.西藏自治区畜牧总站，拉萨 850000；3.西藏农牧学院动物科学学院，林芝 860000；4.西藏牧乐农业科技有限公司，拉萨 850009）

半胱胺对4℃保存藏猪精液指标的影响

陈晓英1，马金英1，宋天增1，唐建华2，赵彦玲3，任子利3，朱彦宾1，王良润4

（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009；2.西藏自治区畜牧总站，拉萨 850000；3.西藏农牧学院动物科学学院，林芝 860000；4.西藏牧乐农业科技有限公司，拉萨 850009）

试验旨在研究半胱氨酸对4℃藏猪精液品质和抗氧化保护作用影响，采用电刺激法采集健康藏猪精液，在改进的猪精液低温稀释液为基础液中，每1 000 mL添加半胱氨酸0、0.02、0.04、0.06、0.08 g，将藏猪种公猪新鲜精液做4倍稀释后于4℃环境保存至第5天，以藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率为评价精液品质指标，以超氧化物歧化酶（Superoxidas dismutase,SOD）活力和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量为评价抗氧化保护作用指标，探讨半胱氨酸对4℃藏猪精液品质影响。结果显示：半胱氨酸0.06 g/L添加组藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率均极显著好于其他试验组（P＜0.01），0.06 g/L半胱氨酸添加组的精浆超氧化物歧化酶活力含量均显著好于其他试验组（P＜0.05），0.08 g/L半胱氨酸添加组的精浆丙二醛含量均显著好于其他试验组（P＜0.05）；同时发现，0.08 g/L半胱氨酸添加组精子超氧化物歧化酶活力最高，各组间差异不显著，精子丙二醛含量0.06 g/L半胱氨酸含量最高。总之，在改进的猪精液稀释液中添加0.06 g/L半胱氨酸后将藏猪种公猪精液做4倍稀释，可明显改善4℃环境保存藏猪精液品质和抗氧化保护作用，该试验研究为今后藏猪精液低温保存的生产应用奠定了基础。

半胱氨酸；藏猪；4℃环境；精液品质；抗氧化保护

半胱胺（cysteamine,Cs），又名β-巯基乙胺，分子式为NH2-CH2-CH2-SH，为半胱氨酸脱羧产物，是辅酶A（CoA）分子的组成部分，也是动物体内的生物活性物质。

半胱氨酸是细胞内谷胱甘肽生物合成的前体物质[1]。Bilodeau等[2]证明像半胱氨酸之类的巯醇物质，可以保护冷冻-解冻后的牛精子活力免受过氧化氢的伤害。10℃下添加半胱氨酸可以提高猪精子的活力、顶体完整性和体外穿透性[3]。何兰花等[4]在含有氨基丁三醇和半胱胺酸的猪精液常温保存稀释粉中添加庆大霉素（100 IU/mL）和林肯霉素（200 μg/mL）作抗生素，在24～30℃、pH为6.4、稀释倍数为1∶1时保存效果最佳。孙琪[5]试验表明以向猪精液稀释液中添加2 mM的半胱氨酸提高三元杂交种猪精子保存质量为最佳。马乃祥[6]研制的猪精液稀释液配方含有半胱胺酸0.07 g，精液能够达到体外恒温保存6 d时间，精子平均活力达0.7，与配繁殖母猪发情期受胎率达86%，窝产仔数平均11.2头，仔猪产后死亡率减少13%，猪群健康率平均提高32%的技术指标。高效精液稀释液应用于养猪生产并取得良好效果。

4℃低温保存，精子代谢活动水平低，脂质过氧化程度低，保存时间比常温更长，同时可应用普通冰箱保存，经济方便[7]。随着现代化藏猪养殖生产技术的提高，为有效控制疫病传播、降低饲养公猪的费用、提高猪群品质，解决藏猪精液的妥善保存问题，人工授精技术服务于藏猪产业发展已迫在眉睫。任子利等[7]研究了维生素C对藏猪精液4℃保存及其精子全基因组DNA甲基化的影响。本研究拟在此研究的基础上，在改进的猪精液低温稀释液为基础液中，每1 000 mL添加半胱氨酸0、0.02、0.04、0.06、0.08 g，将藏猪种公猪新鲜精液做4倍稀释后于4℃环境保存至第5天，以藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率为评价精液品质指标，以超氧化物歧化酶（Superoxidas dismutase,SOD）活性和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量为评价抗氧化保护作用指标，探讨半胱氨酸对4℃藏猪精液品质的影响。以期为藏猪精液低温保存的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物与材料

1.1.1 试验动物与试验地点 试验藏猪为3～5岁健康种公猪6头。试验时间为2015年5—7月，试验地点为西藏工布江达县错高乡某藏猪养殖专业合作社、西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所和西藏大学农牧学院动物科学学院。

1.1.2 主要设备与试剂 动物电刺激采精仪（MDW-1，成都华智开物科技有限公司），倒置荧光显微镜（IX73，奥林巴斯），电热恒温水槽（DKB-450A，上海森信），变频冰箱（BCD-649WDVC，海尔），-80℃冰箱（MDF-U33V，合肥荣事达三洋电器股份有限公司）。

半胱氨酸（Sigma公司）、考马斯亮蓝（国药集团化学试剂有限公司）、Diff-Quik Stain染液（北京普博斯）、亚卫精液稀释粉（丹麦）、速眠新Ⅱ（吉林省敦化市圣达动物药品有限公司）、SOD试剂盒和MDA测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

新鲜藏猪精液由西藏工布江达县错高乡某藏猪养殖专业合作社提供。

1.2 试验方法

1.2.1 改进的低温稀释液配制 参照孙时军等[8]的试验结果，使用亚卫牌精液稀释剂作为基础稀释剂，在稀释后的精液中加入1%乙二醇作为低温保护剂。

1.2.2 精液采集及处理 采用速眠新Ⅱ（0.1 mL/kg）肌内注射麻醉健康藏猪种公猪，用动物电刺激采精仪于3 V、50 mA条件下电刺激法采集健康藏猪精液。

将藏猪精液（精子活力0.8以上）做4倍稀释，用6层以上纱布包裹后放入培养箱中，17℃平衡2 h后，放入冰箱4℃保存。

1.2.3 精子质量评价 精子活力和精子畸形率两项精液常规性状参照世界卫生组织标准（WHO）[9]的方法测定，具体方法如下。

精子活力：精液过滤后立即在显微镜下观察精子活力，采用百分制法，直线前进精子数占总精子数的百分比为精子活力。

精子畸形率：采用龙胆紫酒精溶液染色法，将精子涂片染色，在400倍显微镜下观察，计算不同视野500个精子中畸形精子占比例即为畸形率（取3次计算的平均值）。

精子顶体完整率和精子质膜完整率两项精液性状参照文献[10]进行评价。精子顶体完整率：考马斯亮蓝R250染色法。精子质膜完整率：低渗肿胀试验—HOST。

1.2.4 精液抗氧化指标的测定 超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量的测定，使用SOD试剂盒和MDA测定试剂盒，采用比色法测定精浆和精子中总SOD的活性及MDA含量。具体方法参照文献[11]进行。

1.3 试验设计

1.3.1 半胱氨酸对4℃保存藏猪精液品质的影响试验分5组，在改进的猪精液低温稀释液为基础液中，每1 000 mL添加半胱氨酸0、0.02、0.04、0.06、0.08 g，将藏猪种公猪新鲜精液做4倍稀释后于4℃保存到第5天时以藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率为评价指标，探讨半胱氨酸对4℃保存藏猪精液品质的影响。试验重复3次。

1.3.2 半胱氨酸对4℃保存藏猪精液抗氧化保护作用的影响 试验分组同1.3.1。每次采精后收集精液，取10 mL鲜精液于玻璃离心管中，在4 000 r/min离心分离15 min，取精浆分装于2 mL塑料离心管，置-80℃冰箱保存备用，用于精浆生化参数及抗氧化指标的测定。试验重复3次。

1.4 数据处理

所得试验数据用Excel进行前期处理，再用SPSS 11.5软件进行One-Way ANOVA方差分析，并进行多重比较，试验结果用平均数±标准差表示，检验误差为5%和1%。

2 结果与分析

2.1 半胱氨酸对4℃保存藏猪精液品质的影响

由表1可以看出，6头3～5岁健康种公猪精液4℃保存到第5天时，0.06 g/L半胱氨酸添加组的精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率这4个指标均极显著好于其他组（P＜0.01）。

表1 半胱氨酸对4℃保存藏猪精液品质的影响（n=18）

2.2 半胱氨酸对4℃保存藏猪精液抗氧化保护作用的影响

由图1和图2可以看出，藏猪精液4℃保存到第5天时，0.06 g/L半胱氨酸添加组的精浆超氧化物歧化酶活力含量均显著好于其他试验组（P＜0.05），0.08 g/L半胱氨酸添加组的精浆丙二醛含量均显著好于其他试验组（P＜0.05）；同时发现，0.08 g/L半胱氨酸添加组精子超氧化物歧化酶活力最高，各组间差异不显著，精子丙二醛含量0.06 g/L半胱氨酸含量最高。

图1 半胱氨酸对4℃保存藏猪精浆SOD活力和MDA含量的影响

图2 半胱氨酸对4℃保存藏猪精子SOD活力和MDA含量的影响

3 讨论

谷胱甘肽和半胱氨酸能有效阻止冷冻解冻中过氧化氢诱导的活力丧失[2]，谷胱甘肽和半胱氨酸都可以提高猪精液的液态保存效果。使用亚卫牌精液稀释剂作为基础稀释剂，在稀释后的精液中加入1%乙二醇作为低温保护剂，在改进的猪精液稀释液中添加0.06 g/L半胱氨酸后将藏猪种公猪精液做4倍稀释，可以明显改善藏猪精液4℃保存的效果，对高海拔地区藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率为优；同时可明显提高4℃保存对藏猪精液抗氧化保护作用，本试验研究发现，在猪精液低温稀释液中添加半胱氨酸，精子超氧化物歧化酶活力有所提高，但差异不显著。这说明半胱氨酸作为细胞内谷胱甘肽生物合成的前体对维持精子各项生理指标[1]，抵抗DNA损伤有很明显的效果。

4 结论

本研究结果表明，使用亚卫牌精液稀释剂作为基础稀释剂，在稀释后的精液中加入1%乙二醇作为低温保护剂，在改进的猪精液稀释液中添加0.06 g/L半胱氨酸后将藏猪种公猪精液做4倍稀释，可以明显改善藏猪精液4℃保存的效果，同时可明显提高4℃保存对藏猪精液抗氧化保护作用。本试验研究将为藏猪精液低温保存的生产应用奠定基础。

[1]Meister A,Tate S S.Glutathione and related gamma-glutamyl compounds:biosynthesis and utilization[J].Annu Rev Biochem, 1976,45:559-604.

[2]Bilodeau J F,Blanchette S,Gagnon C,et al.Thiols prevent H2O2-mediated loss of sperm motility in cryopreserved bull semen[J].Theriogenology,2001,56:275-286.

[3]Funahashia H,Sano T.Select antioxidants improve the function of extended boar semen stored at 10℃[J].Theriogenology, 2005,63(6):1605-1616.

[4]何兰花，周美华，陆少华，等.猪精液常温保存的试验[J].黑龙江动物繁殖，2005，13（4）：8-9.

[5]孙琪.不同抗氧化剂对猪精液常温保存的影响[D].哈尔滨：东北农业大学，2009.

[6]马乃祥.猪高效精液稀释液研究与应用效果评价[D].海口：海南大学，2013.

[7]任子利，赵彦玲，王建洲，等.维生素C对藏猪精液4℃保存及其精子全基因组DNA甲基化的影响[J].畜牧兽医学报，2016，47（5）：1057-1061.

[8]孙时军，朱华鸿，陈晓峰，等.低温保护剂对4℃保存猪精液活率的影响[J].上海畜牧兽医通讯，2012（4）：28-29.

[9]WHO.Laboratory test handbook about the interaction between semen and cervical mucus[M].PressⅢ,Beijing:Scientific Editor,1994:9-13.

[10]胡传活，许春荣，陆媚，等.黄芪多糖对猪精液低温保存的影响[J].中国兽医学报，2015，35（1）：150-154.

[11]白小龙.饲粮添加不同类型油脂对种公猪及雄性SD大鼠繁殖性能的影响[D].雅安：四川农业大学，2011.

（编辑：郭玉翠）

Effect of Cysteamine on Tibetan Boar Semen Preserved at 4℃and Antioxidative

CHENXiaoying1,MAJinying1,SONGTianzeng1,TANGJianhua2,ZHAOYanling3,RENZili3,ZHUYanbin1,WANGLiangrun4
(1.Institute of Animal Science,Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Lhasa 850009, China;2.The Tibet Animal Husbandry Service,Lhasa 850000,China;3.Faculty of Animal Science,Tibet Agricultural and Animal Husbandry College,Nyingchi 860000,China;4.Tibet Mulo Agricultural Sciences and Technology Co., Ltd.,Lhasa 850009,China)

This study was conducted to investigate the effects of Cysteamine on Tibetan boar semen preserved at 4℃and antioxidative.The semen was collected from Tibetan boar by electrical stimulation.Add Cysteamine 0 g,0.02 g, 0.04 g,0.06 g,0.08 g per 1 000 mL,in the improvement of pig semen low temperature dilution liquid.Save to fifth days at 4℃after dilution of fresh semen.Body integrity and membrane integrity rate of the top Tibetan pig sperm activity, sperm abnormal rate and semen quality evaluation index,to investigate the effect of Cysteamine on the quality of semen quality at 4℃,the activity of Superoxidas dismutase(SOD)and Maleic dialdehyde(MDA)were the indexes to evaluate the protective effect of antioxidation.The results show that,The sperm motility,sperm deformity rate,sperm motility rate and plasma membrane integrity rate of the Cysteamine 0.06 g/L addition group were significantly better than other test groups(P＜0.05),Seminal superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)content were significantly better than other experimental groups(P＜0.05),added Cysteamine was in pig semen at low temperature. Also,at the same time,we found that,0.08 g/L Cysteamine supplementation group sperm superoxide dismutase(SOD) activity is the highest,But the difference was not significant between the groups.And The content of MDA in sperm was highest in 0.06 g/L group.In short,adding 0.06 g/L Cysteamine to the improved pig semen diluent and semen to do 4 times dilution,it can significantly improve the semen quality and antioxidant protection at 4℃.The experimental study laid a foundation for the production and application of cryopreservation of boar semen in the future.

Cysteamine;Tibetan pig;environmental science at 4℃;semen quality;antioxidant protection

S828

A

1002-1957(2016)06-0022-03

2016-10-05

西藏自治区2016年高校青年教师创新支持计划项目（NO.QCZ2016-47）；西藏自治区2016年农林业科技成果转化与推广（农牧业技术推广）项目“特色畜禽（藏猪）营养调控研究”

陈晓英（1981-），女，甘肃武威人，助理研究员，硕士，主要从事高原畜禽繁殖技术研究工作.E-mail：chenxiaoying0891@163.com

宋天增（1980-），男，助理研究员，硕士，研究方向为动物繁殖营养调控与遗传育种.E-mail：songtianzeng123@sina.com