转化生长因子β1和细胞外信号调节激酶1/2在冠心病猝死早期心肌缺血中的表达及意义

章丽霞，王宇，张丽华，牛彩琴

(1.川北医学院，四川 南充 637000；2.平凉市妇幼保健医院，甘肃 平凉 744300)



转化生长因子β1和细胞外信号调节激酶1/2在冠心病猝死早期心肌缺血中的表达及意义

章丽霞1，王宇2，张丽华1，牛彩琴1

(1.川北医学院，四川 南充 637000；2.平凉市妇幼保健医院，甘肃 平凉 744300)

目的：了解冠心病猝死(sudden coronary death，SCD)者心肌中TGF-β1和ERK1/2中的表达情况，探讨其对SCD 诊断的意义。方法：采用免疫组织化学方法检测转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)在30 例SCD心肌样本(SCD组)和15 例非心源性即刻死亡心肌样本(对照组)的表达情况。结果：SCD组心肌TGF-β1和ERK1/2 的表达明显高于对照组，t值TGF-β1为19.807，ERK1/2 为15.478，两种指标组间比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；TGF-β1和ERK1/2在SCD组中的表达呈正相关(r=0.642,P<0.01)。结论：心肌缺血激活TGF-β1/ERK1/2信号通路，使其在心肌中表达明显升高，检测TGF-β1和ERK1/2可为SCD 的早期心肌缺血病理诊断提供客观指标。

冠心病猝死；转化生长因子β1；细胞外信号调节激酶1/2；免疫组织化学

细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族成员之一,是Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的重要成分,ERK1/2被激活后，形成磷酸化的ERK(P-ERK)，介导信号传递，参与调节细胞的生长、发育、分化等多种生理过程[1]。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是MAPK信号通路的上游信号，TGF-β1参与心肌的修复和重塑[2]。研究表明，在心肌缺血/再灌注过程中激活ERK1/2的信号通路。本文通过免疫组织化学方法，检测TGF-β1和ERK1/2在冠心病猝死(sudden coronary death，SCD)心肌和非心源性原因即刻死亡者心肌中的表达情况，旨在探讨TGF-β1/ERK1/2对冠心病猝死早期病理形态诊断的提供客观指标。

1 材料与方法

1.1 样本及分组

SCD组来自川北医学院附属医院病理科2010年1月至2015年12月SCD早期心肌缺血标本30例，男性 25 例，女性 5 例，年龄42～71岁，平均年龄(46.8±1.53)岁。早期心肌缺血诊断标准参考《中华外科病理学》[3]及相关文献[4]，即死者生前发病至死亡在24 h内，排除暴力死和其它疾病致死可能，冠状动脉主干或至少有1只冠状动脉分支狭窄程度≥Ⅲ级，尸检及常规病理学检查证实为早期心肌缺血(未发展到典型的心肌梗塞)。对照组15例，男性13例，女性2例，年龄17～68岁，平均年龄(34.2±2.04)岁，死者为交通事故或高坠导致严重颅脑损伤，经系统尸检排除其他死因并证实死者生前均由非心源性原因引起即刻死亡，冠状动脉硬化病变程度在Ⅱ级以下。

1.2 试剂与方法

SCD组和对照组心肌样本均用10%甲醛固定，SCD组取心肌典型病变部位，对照组取与SCD组相对应的心肌。样本大小为1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，经常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，所有心肌样本连续切片3 张，切片厚度3 μm，贴于组织防脱载玻片上，置于60 ℃烤箱中烘干后，取切片脱蜡至水，进行常规HE 染色以及免疫组织化学染色。

TGF-β1和ERK1/2免疫组织化学染色：兔抗人TGF-β1多克隆抗体(abcam，ab92486)，兔抗人ERK1/2多克隆抗体(abcam，ab32538)；均用0.01mmol /L pH 6. 0 枸橼酸钠缓冲液进行抗原高压修复，已知宫颈癌切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为空白对照。即用型快速免疫组织化学Maxvision检测试剂盒、DAB显色试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术开发公司。按试剂盒说明书步骤操作，进行免疫组织化学( 二步法) 染色，苏木素复染细胞核。

1.3 结果判断

TGF-β1和ERK1/2均以细胞浆内出现散在棕黄色或棕黑色颗粒为阳性，每张切片随机观察10 个10×20视野并拍照，按切片中显色细胞的比例判定，染色阳性细胞数>10%且染色强度为棕黄色，即记为阳性，否则为阴性。采用Image pro plus 6.0 图像分析软件对目的蛋白表达含量进行分析，分别测定TGF-β1和ERK1/2的光密度值A，以10个视野的A 值的平均值作为各标本的TGF-β1和ERK1/2的表达值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 肉眼检查和HE染色结果

SCD组：冠状动脉在主干或至少1个分支存在管腔狭窄，管腔狭窄Ⅲ级有 22 例，Ⅳ级8例；其中冠状动脉粥样硬化发生在左主干有4例(Ⅳ级管腔狭窄)，左前降支(LAD)有15例(Ⅲ、Ⅳ级管腔狭窄分别为13、2例)，左旋支4例(Ⅲ级管腔狭窄) ，右主干有5例(Ⅲ、Ⅳ级管腔狭窄分别为3、2例)，左前降支与左旋支均有Ⅲ级管腔狭窄1例，左前降支与右主干均有Ⅲ级管腔狭窄1例，无血栓形成和/或斑块破裂，心肌未见异常。HE染色结果显示心肌细胞浊肿，横纹消失，部分心肌波浪样变，心肌灶性或片状嗜伊红染色增强，心肌纤维断裂，收缩带形成(图1A)。

对照组：未见冠状动脉主干狭窄，2例左旋支、1例左旋降支粥样硬化，其管腔狭窄程度均在Ⅱ级度以下外，未发现心脏有异常情况。HE染色未见异常(图1B)。

2.2 TGF-β1和ERK1/2免疫组织化学染色结果

TGF-β1和ERK1/2均主要表达在胞浆，呈棕黄或棕褐色颗粒且较为弥散，偶见在胞浆和细胞核表达；小血管及间质炎细胞多为均质状棕褐色，心肌间质不表达。 TGF-β1在 SCD组心肌表达呈强阳性(图2A)，在对照组呈弱阳性表达(图2B)，其光密度值分别为(94.822±5.333)和(30.421±14.841)，两组比较差异有统计学意义(t=19.807，P<0.01)。ERK1/2在SCD组和对照组心肌的免疫组化结果与TGF-β1类似，ERK1/2在SCD组表达(95.618±10 720)高于对组的表达(30.611±15.869)，其差异有统计学意义(t=15.478，P<0.01)。

本试验亦对TGF-β1和ERK1/2在SCD组中的表达进行相关性分析，TGF-β1和ERK1/2在SCD组中表达呈正相关(r= 0.64，P<0.01)。

3 讨论

TGF-β1是一个强有力的促纤维化细胞因子，通过自分泌和旁分泌作用于成纤维细胞，使成纤维细胞表型改变，显著提高胶原合成能力[5-6]，促进胶原蛋白和纤维连接蛋白合成；下调基质金属蛋白酶并上调其组织抑制剂，从而促进细胞外基质沉积参与心肌细胞促进心肌间质纤维化的发生与发展[7-8]。本次试验结果显示：TGF-β1在SCD组的光密度值高于对照组心肌，两组差异有统计学意义(P<0.05)，表明急性缺血性心肌损伤可导致心肌中TGF-β1表达增加，提示缺血性损伤激活TGF-β1，活化的TGF-β1与靶细胞膜上的特异性受体相结合介导信号转导，调节细胞生长分化与组织修复，参与炎症和免疫等生物效应[9]。因此，TGF-β1 是缺血后从炎症阶段向瘢痕形成过渡的关键因子[10]。

ERK1/2在正常心肌细胞中低表达。心肌缺血再灌注损伤后，氧化应激激活ERK1/2通路[11]，而ERK1/2在缺血再灌注损伤的恢复中起着重要作用[12]。本次试验检测到ERK1/2在SCD组的光密度值明显高于对照组，两组差异有统计学意义(P<0.01)，表明ERK1/2参与急性心肌缺血的损伤过程，其机制可能是缺血损伤激活ERK1/2，被激活的ERK1/2可抑制心肌缺血/再灌注损伤诱导的细胞凋亡[13]。因此，ERK1/2通过参与缺血损伤后适应的心脏保护作用而降低梗死面积[14-15]。体外实验和动物实验均表明ERK1/2 信号转导通路参与心肌缺氧预处理对心肌细胞的保护作用[16-17]。

本试验通过相关性分析发现，TGF-β1和ERK1/2在SCD组心肌中表达呈正相关(r=0.64，P<0.01)，其机制可能是TGF-β1作为MAPK信号通路的上游信号的激活剂，激活MAPK信号通路[10,18]，使ERK1/2激活，ERK1/2激活后抑制细胞凋亡和促进细胞存活进而保护损伤的心肌[19-20]。提示TGF-β1/ERK1/2 信号通路参与并介导心肌缺血后适应的保护作用。

综上所述，心肌缺血损伤后可激活TGF-β1/ERK1/2信号通路，使TGF-β1和ERK1/2表达增高，提示TGF-β1和ERK1/2可作为判断SCD猝死早期形态诊断的有用指标，具有法医学意义。

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(学术编辑：刘云)

Expression and significance of TGF-β1 and ERK1/2 in the sudden death of coronary heart disease early myocardial ischemia

ZHANG Li-xia1，WANG Yu2，ZHANG Li-hua1，NIU Caiqin1

(1.NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan；2.PingliangMaternalandChildHealthCareHospital,Pingliang744300,Gansu,China)

Objective：To observe the expressions of transforming growth factor-β1(TGF-β1) and extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) in the myocardium of patients of sudden coronary death and to explore the significance of SCD diagnosis.Methods：The heart samples of thirty cases of sudden coronary death were chosen as experiment group while the heart samples of fifteen cases of non sudden coronary death were chosen as control group. Immunohistochemical staining was employed to examine the expressions of TGF-β1 and ERK1/2 in the myocardium． Results：The expressions of TGF-β1 and ERK1/2 in experiment group was significantly higher than those in control group，the t value of TGF-β1 was 19.807,ERK1/2 was 15.478,two indicators between two groups were compared,the differences were statistically significant (P<0. 01) .The expressions of TGF-β1 positively related to ERK1/2 in SCD(r=0.64，P<0.01).Conclusion：TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway could participate in the process of apoptosis,the detection of the positive expressions of two indicators in the myocardium may provide an objective index for the early pathological diagnosis of SCD.

Sudden coronary death；Transforming growth factor-β1；Extracellular signal-regulated kinase 1/2；Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.06.009

四川省教育厅课题(12ZB225，14ZA0182)

2016-04-08

章丽霞(1977-)，女，硕士，副教授。

牛彩琴，E-mail：niucaiqin@126.com

时间：2017-1-3 22∶01

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170103.2201.018.html

1005-3697(2016)06-0813-03

R541.4

A