猪伪狂犬病毒gB和gC蛋白B细胞表位编码序列的融合表达及活性测定

张 冲，刘 芳，赵 东，邓瑞广，张改平,3，李学伍*

(1.河南科技大学 动物科学技术学院，河南 洛阳 471003； 2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002； 3.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

猪伪狂犬病毒gB和gC蛋白B细胞表位编码序列的融合表达及活性测定

张 冲1,2，刘 芳1，赵 东2，邓瑞广2，张改平2,3，李学伍2*

(1.河南科技大学 动物科学技术学院，河南 洛阳 471003； 2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002； 3.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

依据猪伪狂犬病毒gB和gC蛋白的B细胞表位编码序列，分别设计gB和gC蛋白B细胞表位编码序列的融合扩增引物，利用融合PCR技术，将gB和gC蛋白B细胞表位编码序列有机地融合为gB-C表位编码序列。将融合基因片段插入到原核表达载体pET28a，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果显示，融合蛋白gB-C能够高效表达，重组蛋白的分子质量约为38 ku；经Western blot鉴定分析，小鼠抗His标签单克隆抗体和PRV阳性血清均能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了融合蛋白gB-C，且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。

猪伪狂犬病毒； gB蛋白； gC蛋白； B细胞表位； 融合表达

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(PRV)引起，造成母猪严重繁殖障碍以及仔猪高死亡率的传染病。PRV感染导致机体免疫抑制，引起其他病原如猪圆环病毒、猪链球菌和猪肺炎支原体等的继发性感染和混合感染，是危害养猪业最严重的病毒性疾病之一[1-2]。PRV 基因组为线状双链 DNA 分子，大小约为 150 kb，G+C 含量高达 73%，分子质量约 9.5×103ku，属线状双链DNA 病毒。糖蛋白 gB(gⅡ)、gC(gⅢ)均被定位于UL区。到目前为止，已证实 gB对病毒体内增殖是非必需的，而 gC为病毒复制所必需[3]。在疱疹病毒中，gB蛋白既是良好的保护性抗原又是可靠的免疫检测抗原。gB蛋白由gBa、gBb和gBc 3个糖蛋白通过二硫键共价连结而成。gBb、gBc由gBa剪切而来；gB蛋白通常包含2个gBb和2个gBc分子。gBc、gBb存在多个结构表位和线性表位[4-5]。gB蛋白诱导产生的抗体能中和病毒阻止感染传代细胞，gB蛋白免疫的小鼠能够抵抗PRV的攻击免受病毒的感染。gC蛋白也是PRV的重要功能蛋白质之一，广泛存在于PRV囊膜表面[6]，gC蛋白能够与宿主细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白(HS)结合，从而启动病毒对细胞的侵入，病毒囊膜与细胞膜融合始于gC蛋白与HS的结合[7]。gC蛋白诱导产生的中和抗体主要识别HS结合区域内的B细胞表位[8]。gC蛋白单抗能够体外中和病毒，同时也能保护小鼠和猪免受病毒感染[9]。因此，gC蛋白的B细胞表位也可用于亚单位疫苗的制备。gB、gC的中和抗体水平是评价免疫保护效率的重要指标之一。目前，基于PRV融合中和抗体的诊断试剂的研究较少，为此，本研究利用融合PCR技术将gB和gC片段融合(命名为gB-C)，并利用基因工程方法原核表达gB-C重组融合蛋白，为猪群免疫水平检测及亚单位疫苗的制备奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、载体及毒株 大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞购自天根生物公司，pMD19-T vector购自宝生物工程(大连)有限公司。PK-15细胞、PRV毒株、表达载体pET28a、BL21(DE3)感受态细胞均由农业部动物免疫学重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、LATaqDNA聚合酶、限制性内切酶2×GC Buffer、BamHⅠ、HindⅢ、dNTP均购自宝生物工程(大连)有限公司。PRV阳性血清、His标签抗体(一抗)、羊抗猪IgG(二抗)均由农业部动物免疫学重点实验室保存。

1.1.3 引物设计 依据GenBank中PRV BJ/YT株gB和gC蛋白B细胞表位编码序列设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列为gB-C-P1:5′-CCGGGATCCCTTTGGCCTGCTCCACACCACGCTG-3′；gB-C-P2:5′-GCTCGCCCGC-GCTGCTGTTGCCGCCGGACGGCGGCGGGCAGACGT-AGAAGC-3′;gB-C-P3:5′-CCGGGATCCGGCGGCAACAGCAGCGCGGGCGAGC-3′；gB-C-P4:5′-CCCAAGCTTCTATTAGCGCGGGGGCTCGTCAA-AGTACTCG-3′。融合扩增片段长度为708 bp。

1.2 方法

1.2.1 PRV病毒基因组的提取 PK-15细胞形成单层后弃去生长液,接种200 μL PRV病毒液，在吸附2 h后加维持液，当70%细胞出现病变和脱落后，收集全部细胞培养物。在500 μL细胞培养物中，加入6 μL蛋白酶K、94 μL 10% (m/V)SDS，混匀，55 ℃加热30 min；接着将等体积酚-氯仿加入，颠倒混匀，12 000 r/min离心5 min；收集上清，再加入等体积氯仿，混匀，12 000 r/min离心5 min；将上清收集并加入2倍体积冷乙醇颠倒混匀，-20 ℃静置 10～20 min，12 000 r/min离心10 min；用70%的乙醇将沉淀洗涤1次，放到超净台使残留乙醇挥发干净；用25 μL含RNase (20 μg/mL)的灭菌去离子水溶解，尽快使用或置于-20 ℃条件下保存。

1.2.2 PRV病毒基因组的鉴定 根据参考文献[3]合成如下引物，用来鉴定伪狂犬病毒，p1:5′-CACGGAGGACGAGCTGGGGCT-3′;p2:5′-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3′。以病毒DNA作为模板，鉴定PCR反应体系为：模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ExTaq预混酶10 μL，ddH2O 7 μL。扩增程序为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s， 31个循环；72 ℃ 10 min。取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3gB-C融合表位编码序列制备 以提取的病毒DNA为模板，利用引物gB-C-P1、gB-C-P2进行gB糖蛋白B细胞表位编码序列的PCR扩增，利用引物gB-C-P3、gB-C-P4进行gC糖蛋白B细胞表位编码序列的PCR扩增。反应体系为20 μL：模板DNA 1 μL，LATaq酶0.2 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×GC Buffer 10 μL，dNTP 1 μL，ddH2O 6.8 μL。混匀后置PCR扩增仪中，95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，69 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。用上述方法分别获得gB和gC糖蛋白B细胞表位编码序列。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统拍照记录结果并进行回收。然后将相同摩尔数的片段gB和gC混合为模板，上、下游引物分别为gB-C-P1、gB-C-P4，进行融合扩增获得糖蛋白B细胞表位融合编码序列。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，69 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统拍照记录结果并进行回收。

1.2.4 pMD19T-gB-C重组质粒的构建 将回收的DNA片段与PMD19-T载体16 ℃过夜连接，将10 μL连接产物加入到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min；42 ℃热休克90 s，迅速置冰上3 min，随后加入1 ml LB培养液，37 ℃ 220 r/min振荡培养1 h。3 000 r/min离心3 min，弃上清，留200 μL悬浮细胞沉淀，涂布含氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB平板，37 ℃过夜培养至菌落出现，进行双酶切及质粒PCR鉴定，构建pMD19T-gB-C重组质粒。

1.2.5 表达载体的构建 将阳性质粒pMD19T-gB-C和表达载体pET28a分别用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切，将酶切回收后的目的片段和表达载体用T4 DNA连接酶连接。将连接产物转化入DH5α感受态细胞中，挑取单克隆，构建质粒pET-28a-gB-C。对pET-28a-gB-C进行质粒PCR和双酶切鉴定。将鉴定为阳性的pET-28a-gB-C菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。

1.2.6 诱导表达 将测序鉴定正确的重组阳性质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，挑菌斑过夜培养，取重组菌液100 μL 接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的100 mL LB培养液中，在温度37 ℃、230 r/min的摇床内培养至OD600为0.6～1.0，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，24 ℃诱导表达8 h。

1.2.7 表达产物的检测

1.2.7.1 SDS-PAGE电泳 配置12%的分离胶。取诱导表达菌液1 mL于1.5 mL 离心管内，12 000 r/min离心2 min。弃上清，用200 μL PBS重悬，加入50 μL 5×Buffer(用前加热)。放入浮漂中，煮沸5 min后，12 000 r/min离心2 min。将未诱导的重组菌作为对照。取20 μL上清上样至电泳槽内，电泳后放入考马斯亮蓝染色液中染色3 h，然后脱色观察。

1.2.7.2 Western blot检测 取NC膜，剪成比蛋白胶稍大的长方形，之后按照滤纸→NC膜→SDS胶→滤纸的顺序放入电转仪(膜与膜之间无气泡)，15 V电转1 h。电转后的NC膜用5%的脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，依次加入一抗、二抗进行处理，最后用AEC显色方法进行显色。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

提取伪狂犬病毒DNA，以此为模板，应用特异性引物PCR扩增，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯光下观察，可见PCR扩增出的片段大小约为217 bp，与预期结果一致(图1)。

M:DNA Marker； 1:正常细胞DNA 模板扩增；2：病毒培养物DNA 模板扩增图1 PRV DNA模板PCR鉴定

以提取的病毒DNA为模板，利用引物gB-C-P1、gB-C-P2进行扩增，获得了与设计大小(346 bp)一致的gB蛋白B细胞表位编码序列的特异条带(图2)。利用引物gB-C-P3、gB-C-P4进行扩增获得387 bp的gC蛋白B细胞表位编码序列的特异性条带(图3)。以扩增出的gB、gC表位编码序列片段为模板，利用引物gB-C-P1、gB-C-P4对其进行融合扩增，获得了与预计大小一致的708 bp的gB-C蛋白B细胞表位融合编码序列的特异条带(图4)。

M：DNA Marker;1：gB蛋白B细胞表位编码序列扩增片段图2 gB蛋白B细胞表位编码序列扩增结果

M：DNA Marker;1：gC蛋白B细胞表位编码序列扩增片段图3 gC蛋白B细胞表位编码序列扩增结果

M：DNA Marker; 1：gB-C融合蛋白B细胞表位编码序列片段图4 gB-C融合蛋白B细胞表位编码序列扩增结果

2.2 pET-28a-gB-C的鉴定结果

2.2.1 酶切鉴定 对重组质粒pET-28a-gB-C用限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切后,经琼脂糖电泳可见目的条带708 bp 和载体条带5 900 bp，与预计的一致(图5)。

M：DNA Marker; 1：pET-28a-gB-C质粒图5 pET-28a-gB-C质粒双酶切鉴定结果

2.2.2 PCR鉴定 以初步鉴定为阳性的重组质粒为模板,用引物gB-C-P1、gB-C-P4按上述扩增条件进行PCR扩增，扩增出了大小约700 bp的条带，与预期结果相符(图6)。

M：DNA Marker;1：gB-C编码序列片段图6 pET-28a-gB-C质粒PCR鉴定结果

2.2.3 序列测定 将阳性重组质粒进行序列分析，插入的基因阅读框架无误，测序结果与预期结果一致(测序图表略)。

2.3 表达产物的鉴定

2.3.1 SDS-PAGE鉴定 重组阳性菌用IPTG在24 ℃诱导表达后，经SDS-PAGE电泳检测，结果显示，诱导的重组菌比未诱导重组菌多出1条分子质量大小约38 ku的目的蛋白条带，与融合蛋白预期大小一致(图7)。由此证明，融合的目的蛋白在原核系统中成功表达。

M：预染Marker；1：pET-28a-gB-C未诱导组； 2：pET-28a-gB-C诱导组图7 gB-C融合蛋白的SDS-PAGE分析结果

2.3.2 Western blot分析 表达产物经SDS-PAGE电泳后，将蛋白质条带转移到NC膜上进行免疫印迹分析。结果显示，在约38 ku大小的位置出现特异性反应条带(图8)。结果证实，表达的融合表位能够被阳性血清识别。

M：预染Marker； 1：阳性血清诱导结合组； 2：阳性血清未诱导结合组； 3：His标签蛋白诱导结合组； 4：His标签蛋白未诱导结合组图8 gB-C融合蛋白的Western blot鉴定结果

3 结论与讨论

猪伪狂犬病对我国养猪业的健康发展造成了极大威胁，猪群病毒净化、提高免疫密度和免疫强度、定期检测猪群的免疫水平，是目前控制此病的有效方法，其中免疫监测尤为重要[10-15]。本试验将PRVgB、gC表位基因应用融合PCR技术连接，采用李敏等[16]的一步融合PCR方法不能得到预期的融合片段，而应用Davidson等[17]两步 PCR方法，获得融合基因gB-C。将融合的gB-C基因片段克隆到原核表达载体pET28a，采用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统， IPTG浓度由0.2 mmol/L升高至1.0 mmol/L，诱导温度由37 ℃降低至24 ℃，诱导时间由2 h提高至8 h，得到的目的蛋白能够识别PRV阳性血清，表明该蛋白具有较好的免疫学活性。

本研究将gB、gC糖蛋白B细胞表位进行融合克隆表达，获得了高纯度的检测抗原，提高了抗体检测的敏感性、特异性和准确性，为制备用于PRV抗体检测的试纸条和ELISA检测试剂盒奠定了基础。

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Fusion Expression and Activity Detection of Porcine Pseudorabies Virus gB and gC Glycoprotein B-cell Epitope Coding Sequences

ZHANG Chong1,2,LIU Fang1,ZHAO Dong2,DENG Ruiguang2,ZHANG Gaiping2,3,LI Xuewu2*

(1.College of Animal Science and Technology,Henan Science and Technology University,Luoyang 471003,China; 2.Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 3.College of Veterinary Medicine and Animal Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

According to PRV B cell epitope sequences of the gB and gC protein，the fusion primers were designed respectively.Using the fusion PCR technology,the gB-Cwas fused by the B cell epitope sequences of the gB and gC protein.Then the gB-Cwas inserted into the pET28a.The recombinant plasmid was transformed intoE.coli(BL21).TheE.coli(BL21)expressed the recombinant protein which was induced with 1 mmol/L IPTG.The result of SDS-PAGE showed that the gB-C was expressed successfully.The molecular weight of the recombinant protein was 38 ku.The result of Western blot showed that the recombinant gB-C protein could be recognized by His-tag mouse Mcab and PRV porcine positive serum.In this research,the recombinant gB-C protein was expressed successfully and the recombinant protein had a good immunological activity.

PRV; gB protein; gC protein; B-cell epitope; fusion expression

2015-07-10

国家自然科学基金项目(31172348)

张 冲(1989-)，男，河南新乡人，在读硕士研究生，研究方向：分子病原学和免疫学。E-mail：421986388@qq.com

*通讯作者：李学伍(1964-)，男，河南通许人，研究员，博士，主要从事动物病原学和免疫学研究。 E-mail：lixuewu2002@126.com

S855.3

A

1004-3268(2016)01-0119-05