绞股蓝内生真菌产胞外多糖发酵条件的优化

李传民,曹 健,张慧茹*,兰亚莉

(1．河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001； 2．河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002)

绞股蓝内生真菌产胞外多糖发酵条件的优化

李传民1,曹 健1,张慧茹1*,兰亚莉2

(1．河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001； 2．河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002)

药用植物绞股蓝内生真菌JY25胞外多糖具有抗癌、抗氧化等多种活性作用，对其发酵条件进行优化，以期达到高产胞外多糖的效果。以胞外多糖产量为检验指标，采用单因素和正交试验对培养时间、接种量、碳源、氮源进行优化。单因素试验结果表明，绞股蓝内生真菌JY25产胞外多糖的最佳培养周期为8 d，最佳接种量为7%，最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母粉；正交试验优化后发现，产胞外多糖的最佳发酵条件为培养时间8 d、接种量5%、葡萄糖添加量40 g/L、酵母粉添加量5 g/L，在此条件下胞外多糖的产量达到271.40 mg/L。

绞股蓝； 内生真菌； 胞外多糖； 发酵条件； 优化

真菌多糖具有天然药物活性和特殊的保健功能，已成为生物学、食品科学、医药科学等领域研究的热点[1]。绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)为葫芦科多年生蔓生草本植物，内含有皂苷、多糖、黄酮、有机酸、生物碱等多种活性成分，具有益气健脾、化痰止咳、清热解毒等多种功效[2]。河南工业大学生物工程学院动物生理实验室从绞股蓝中分离到1株具有高抑菌活性的内生真菌JY25，同时，研究发现该菌株的胞外多糖具有较好的抗氧化、抗肿瘤、抑菌等作用[3]，具有很好的应用前景。目前,国内外尚无关于绞股蓝内生真菌胞外多糖发酵条件优化的研究报道。为此，本研究采用单因素和正交试验对分离出的绞股蓝内生真菌JY25产胞外多糖的发酵条件进行优化，旨在为绞股蓝内生真菌胞外多糖的结构研究及批量生产奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 绞股蓝内生真菌JY25菌株：由河南工业大学生物工程学院动物生理实验室分离鉴定。

1.1.2 试验用培养基 PDA固体培养基：马铃薯200 g，切碎，水煮沸20 min，取上清，加葡萄糖20 g、琼脂糖15～20 g，定容至1 000 mL。121 ℃灭菌20 min。

PDA液体培养基：马铃薯200 g，切碎，水煮沸20 min，取上清，加葡萄糖20 g、定容至1 000 mL。121 ℃灭菌20 min。

基础液体培养基：葡萄糖30 g/L、酵母粉3 g/L。

1.1.3 主要仪器 721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)、快速混匀器(金坛市华峰仪器有限公司)、生化培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的制备 采用苯酚-硫酸法制备葡萄糖标准曲线[4]。将葡萄糖置于105 ℃烘箱中，烘干至恒质量，精确称取烘干的葡萄糖0.255 g，蒸馏水定容于100 mL容量瓶中，即为葡萄糖标准液母液。精确量取10 mL母液移至250 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至250 mL，即为葡萄糖标准液。取6支试管，用移液枪分别加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL葡萄糖标准液，并用蒸馏水补足至2 mL。在每只试管中分别加入1 mL 5 %的苯酚和5 mL浓硫酸。在漩涡振荡器上振荡均匀，静置20 min。以不加葡萄糖标准液的反应液作为空白对照调零，测490 nm下的吸光度值(x)，获得葡萄糖标准曲线y=0.010x-0.002，R2=0.999，y为葡萄糖质量浓度。

1.2.2 胞外多糖含量的测定 将发酵液抽滤去除菌丝体，在60 ℃条件下旋转蒸发将发酵液浓缩至原体积的1/5，加入4倍发酵液体积的无水乙醇，4 ℃静置过夜，3 000 r/min离心10 min，取沉淀，即为发酵胞外多糖。用蒸馏水将其溶解至250 mL容量瓶中并定容。取1 mL加入试管中，以苯酚-硫酸法测定其在490 nm处吸光度值，通过标准曲线获得胞外多糖含量。

1.2.3 种子液的制备 取斜面保存的JY25菌种转接到PDA平板，28 ℃活化培养4 d。将长势良好的菌丝转接于PDA培养基平板，28 ℃培养4 d，用直径约0.5 cm的打孔器取菌饼3块，接种于PDA液体培养基中，26 ℃、150 r/min培养4 d，加入适量玻璃珠和磁转子搅拌30 min，将菌丝球打碎，作为种子液接种。

1.2.4 单因素试验

1.2.4.1 培养时间 使用250 mL三角瓶分装100 mL基础液体培养基，接种3%的种子液，26 ℃、150 r/min培养，每隔1 d抽取培养液，检测胞外多糖产量，培养14 d，确定产胞外多糖的最适培养时间。

1.2.4.2 接种量 使用250 mL三角瓶分装100 mL基础液体培养基，分别接种1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%的种子液，26 ℃、150 r/min培养一段时间(1.2.4.1确定的最适培养时间)，检测胞外多糖产量，确定产胞外多糖的最适接种量。

1.2.4.3 碳源 在上述优化试验的基础上，以3 g/L的酵母粉为唯一氮源，分别选用30 g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、淀粉为碳源进行优化，26 ℃、150 r/min培养，检测胞外多糖产量，确定产胞外多糖的最优碳源。

1.2.4.4 氮源 在上述优化试验的基础上，分别选用3 g/L的酵母粉、蛋白胨、尿素、胰蛋白胨、黄豆饼粉、硝酸钠、硫酸氨为氮源进行优化，26 ℃、150 r/min培养，检测胞外多糖产量，确定产胞外多糖的最优氮源。

1.2.5 正交试验 依据单因素试验结果，对绞股蓝内生真菌产胞外多糖发酵条件中的培养时间、接种量、葡萄糖添加量、酵母粉添加量进行四因素三水平正交试验L9(34)，以优化产胞外多糖发酵条件，试验设计见表1。

表1 绞股蓝内生真菌产胞外多糖发酵条件的

1.3 数据处理

所有试验数据均用SPSS 8.1进行分析。

2 结果与分析

2.1 绞股蓝内生真菌产胞外多糖发酵条件的单因素试验结果

2.1.1 培养时间 由图1可知，随着培养时间的推移，胞外多糖产量逐渐增加，在8 d时达到最大(192.10 mg/L)，之后随着时间的延长而逐渐降低。出现此现象的原因可能是随着菌体的生长，胞外多糖逐渐积累，而当培养基中的原始碳源逐渐被消耗后，菌体的继续生长则利用代谢产生的胞外多糖作为二次碳源，从而出现胞外多糖产量下降的现象。因此，最佳培养时间为8 d。

图1 培养时间对绞股蓝内生真菌胞外多糖产量的影响

2.1.2 接种量 由图2可知，接种量在3%～9%时，胞外多糖产量都比较高，接种量为7%时，胞外多糖产量最高，所以最佳的接种量为7%。

2.1.3 碳源 由图3可知，以葡萄糖为碳源时，胞外多糖产量最高，显著高于其他碳源，其他碳源之间差异相对较小，这可能是因为葡萄糖最容易被JY25吸收，所以葡糖糖为最佳碳源。

图3 碳源对绞股蓝内生真菌胞外多糖产量的影响

2.1.4 氮源 从图4可以看出，以酵母粉为氮源时，胞外多糖产量显著高于其他氮源，蛋白胨、黄豆饼粉次之，其他4种氮源差异较小。这可能是因为酵母粉中的氮来源于真菌蛋白，更容易被真菌吸收利用。由此确定，JY25发酵产胞外多糖的最佳氮源为酵母粉。

图4 氮源对绞股蓝内生真菌胞外多糖产量的影响

2.2 绞股蓝内生真菌产胞外多糖发酵条件的正交试验结果

由表2可以看出，各因素对绞股蓝内生真菌JY25胞外多糖产量的影响顺序为酵母粉添加量>培养时间>接种量>葡萄糖添加量；通过方差分析(表3)进一步发现，酵母粉添加量对胞外多糖产量影响显著，其他因素影响均不显著。绞股蓝内生真菌JY25产胞外多糖的最优发酵条件为A2B1C3D3，即培养时间8 d、接种量5%、葡萄糖添加量40 g/L、酵母粉添加量5 g/L(表2)。

表2 绞股蓝内生真菌产胞外多糖发酵条件的

表3 绞股蓝内生真菌产胞外多糖发酵条件的方差分析结果

注：*表示显著(P<0.05)。

2.3 绞股蓝内生真菌产胞外多糖最优发酵条件的验证试验结果

按照正交试验所得的最优发酵条件进行发酵，3次重复的胞外多糖产量分别为269.04、271.12、274.03 mg/L，平均为271.40 mg/L，高于表2中所有结果。表明经过优化，确实提高了绞股蓝内生真菌JY25胞外多糖的产量。

3 结论与讨论

真菌多糖具有特异的免疫活性，但通常含量比较低。韩苗苗等[5]对白玉菇等4种食用真菌多糖含量的比较研究显示：杏鲍菇的多糖含量最高为52.38%，口蘑的多糖含量最低只有15.63%。因此，对药用植物内生真菌体外高产多糖的培养条件进行优化，具有非常重要的意义。

微生物合成次级代谢产物的能力与培养条件紧密相关，其直接影响代谢方式及代谢物产量，从而影响目的产物产量[6]。目前，国内外学者对内生菌相关活性成分发酵条件的优化研究方法很多，包括正交优化[7]、响应面优化[8]、Plackett-Burman设计[9]等。本试验采用单因素试验和正交试验对绞股蓝内生真菌产胞外多糖的发酵培养时间、接种量、碳源、氮源进行优化，最终确定了绞股蓝内生真菌产胞外多糖的最佳发醇条件：培养时间8 d、接种量5%、葡萄糖添加量40 g/L、酵母粉添加量5 g/L，在此条件下胞外多糖的产量达到271.40 mg/L。为下一步制取精制多糖、检测多糖结构、构效关系研究提供充足的原材料。

[1] 郭天力,严晓娟,胡先望,等.真菌多糖研究进展[J].现代生物医学进展,2013,13(18):3578-3583.

[2] 朴香兰,吴倩.绞股蓝研究进展[J].时珍国医国药,2010,21(7):1758-1760.

[3] 范文慧.抗菌性绞股蓝内生真菌的分离鉴定及生物学活性初步研究[D].郑州：河南工业大学,2012.

[4] 来永斌,王琦,孙月.蛹虫草多糖含量的测定与分析[J].中成药,2001,23(7):517-518.

[5] 韩苗苗,孙一楠,张志阳,等.白玉菇等4种食用真菌多糖含量的比较研究[J].安徽农业科学,2013,41(13):5931-5932，5939.

[6] 钱铭镛.发酵工程最优化控制[M].南京:江苏科学技术出版社,1998:46-58.

[7] 张念海,易安妮,丛莉,等.侧孢芽孢杆菌2002的培养特性及发酵条件优化[J].食品研究与开发,2011,32(3):152-156.

[8] Usha R,Mala K K,Venil C K,etal.Screening of Actinomycetes from mangrove ecosystem for L-asparaginase activity and optimization by response surface methodology[J].Pol J Microbiol,2011,60(3):213-221.

[9] Ali S,Haq I.Production of 3,4-dihydroxy L-phenylalanine by a newly isolatedAspergillusnigerand parameter signifi-cance analysis by Plackett-Burman design[J].BMC Biotechnolgy,2010,10:86.

Optimization of Fermentation Conditions of Extracellular Polysaccharide Produced by Endophytic Fungi fromGynostemmapentaphyllum

LI Chuanmin1,CAO Jian1,ZHANG Huiru1*，LAN Yali2

(1.College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001，China; 2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

Extracellular polysaccharide produced by endophytic fungi JY25 from the medicinal plantsGynostemmapentaphyllumhad anti-cancer,anti-oxidation and other bioactive effects.The fermentation conditions were optimized to obtain the highest EPS.The incubation time,inoculum dose,carbon sources and nitrogen sources were optimized by single factor test and the orthogonal test with the yield of extracellular polysaccharide as the test aim.The optimized results of single factor test showed that the optimum culture cycle was 8 d,the optimum inoculum dose was 7%,the optimum carbon source was glucose,and the optimum nitrogen source was yeast powder.The optimized results of orthogonal test indicated that the optimum culture cycle was 8 d,the optimum inoculum dose was 5%,the optimum application rate of glucose was 40 g/L,and the optimum application rate of yeast powder was 5 g/L,under the above conditions the yield of extracellular polysaccharide reached 271.40 mg/L.

Gynostemmapentaphyllum； endophytic fungi; extracellular polysaccharide； fermentation conditions； optimization

2015-07-02

河南省教育厅自然科学项目科学技术重点研究项目(15A180013)

李传民(1990-)，男，河南信阳人，在读硕士研究生，研究方向：真菌多糖构效关系。E-mail：952686964@qq.com

*通讯作者：张慧茹(1967-)，女，河北鹿泉人，副教授，博士，主要从事药用中草药研究。E-mail：zhr67@163.com

TS201；TQ920

A

1004-3268(2016)01-0143-04