小麦全蚀病菌拮抗菌BacillusmethylotrophicusZ-9菌株产芽孢条件优化

孔少元，吕纪涛，张冬冬，王世英

(河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071000)

小麦全蚀病菌拮抗菌BacillusmethylotrophicusZ-9菌株产芽孢条件优化

孔少元，吕纪涛，张冬冬*，王世英*

(河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071000)

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus) Z-9菌株对小麦全蚀病病原菌有显著拮抗活性，以芽孢产率和活菌数为主要指标，采用单因素试验和正交试验对Z-9菌株摇瓶产芽孢条件进行优化，为其工业生产提供试验依据。通过单因素试验确定最佳碳源、氮源和无机盐分别为玉米粉、黄豆饼粉和MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O。通过正交试验确定最适培养基组分为玉米粉1.0%、黄豆饼粉2.0%、MnSO4·H2O 0.04%、MgSO4·7H2O 0.04%、Na2HPO4·2H2O 0.4%、NaH2PO4·2H2O 0.2%；最适发酵条件为：初始pH值7.5，250 mL三角瓶装液量50 mL，37 ℃培养36 h。优化后发酵液的芽孢数量为1.60×109cfu/mL，较优化前提高了13.7倍，芽孢产率达到96.5%。

小麦全蚀病； 拮抗菌； 芽孢杆菌； 芽孢； 发酵条件； 优化； 芽孢产率

小麦全蚀病是小麦生产上的毁灭性灾害之一，由禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomycesgraminisvar.tritic)引起。小麦发病后，分蘖减少，成穗率降低，千粒质量下降，造成严重减产，甚至绝收[1-3]。目前，缺乏抗小麦全蚀病的品种，化学防治不仅成本高，还会污染环境，并使病原菌产生耐药性[4]。轮作倒茬能降低发病率，但适用于大面积种植，有很大的局限性[5]。生物防治有很大优势，具有防治作用持久、产品无残留等特点，有些微生物还有一定的促生长能力[6]。目前，国内外关于小麦全蚀病微生物防治的研究主要集中在荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)[7]、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)[8]、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)[9]上。芽孢杆菌能够产生抗逆、耐热的芽孢，这有利于生防菌的生产、剂型加工及在环境中存活[10]，而且生产工艺相对简单、成本较低。芽孢杆菌菌剂一般采用芽孢形式，因此产芽孢条件的优化对工业制剂生产有着重要意义。秦艳等[11]通过对蜡样芽孢杆菌发酵条件优化研究，改变了它的生长参数，提高了生物量及芽孢产率。王振海等[12]通过对Bacillusvelezensis发酵条件的优化，使活菌含量达2.33×1010cfu/mL。河北农业大学生命科学学院制药工程系从小麦全蚀病发病地区土壤中筛选到1株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)Z-9，该菌株对小麦全蚀病病原菌有显著拮抗活性，对小麦全蚀病的防治效果也很明显[13]。本试验以芽孢产率和活菌数为主要指标，通过单因素和正交试验对Z-9菌株进行摇瓶产芽孢条件优化，为其工业化生产提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 Z-9菌株由河北农业大学生命科学学院制药工程系从小麦全蚀病发病地区土壤中分离，通过对该菌株的形态特征观察、生理生化特性和16S rDNA序列分析，确定Z-9菌株为Bacillusmethylotrophicus，其对小麦全蚀病病原菌有很好的拮抗活性。

1.1.2 培养基 NA培养基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂20.0 g、蒸馏水1 000 mL，pH值7.2～7.4。种子培养基：蛋白胨1.0%、葡萄糖1.0%、NaH2PO4·2H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%，pH值7.2～7.4。基础发酵培养基：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.0%、Na2HPO4·2H2O 0.4%、NaH2PO4·2H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl2·2H2O 0.02%，pH值自然。

1.2 种子液培养

配制种子培养基，250 mL三角瓶装液量50 mL，121 ℃灭菌20 min。用接种针从Z-9菌株的NA斜面挑取少量的菌苔，接种于装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中。37 ℃、200 r/min摇床培养12 h后备用。

1.3 产孢条件单因素试验

选取7种碳源(可溶性淀粉、乳糖、糊精、葡萄糖、玉米粉、甘露醇、蔗糖)、7种氮源(牛肉膏、硫酸铵、尿素、蛋白胨、酵母膏、黄豆饼粉、胰蛋白胨)及6种无机盐(FeSO4、ZnSO4、CuSO4·5H2O、CaCl2、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O)，在基础发酵培养基的基础上，单因素改变碳源、氮源、无机盐的种类，配制各种发酵培养基，将培养12 h的种子液以2.0%的接种量接入发酵培养基(250 mL三角瓶装液量50 mL)中，37 ℃、200 r/min摇床培养48 h后取样检测菌体生物量和芽孢产量，确定最佳碳源、氮源及无机盐。

1.4 产孢条件正交试验

1.4.1 培养基组成正交试验 根据单因素试验中确定的最佳碳源、氮源和无机盐，按照L9(34)正交试验表配制不同浓度的发酵培养基，在发酵终点测定菌体含量和芽孢数量，计算芽孢产率，正交试验的因素和水平设计见表1。综合正交试验结果确定最佳组合，从而得出Z-9菌株的最佳培养基组成。

表1 培养基组成正交试验因素水平

1.4.2 培养条件正交试验 以最适碳源、氮源、无机盐配制培养基，按照L9(34)正交试验表，研究pH值、温度、装液量及发酵时间对芽孢形成的影响，正交试验水平设计见表2。综合正交试验结果确定最佳组合，从而得出Z-9菌株的最佳发酵工艺条件。

表2 培养条件正交试验因素水平

1.5 生物量和芽孢产量的检测

生物量测定采用细菌计数板计数。芽孢产率测定采用染色法，利用孔雀石绿初染和沙黄复染，在显微镜下观察，芽孢为绿色，菌体为红色。每处理选择5个不同的视野，分别统计芽孢和菌体数量，芽孢产率即芽孢数与总菌数的比值。每处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 培养基单因素试验结果

2.1.1 碳源对Z-9菌株发酵液活菌含量及芽孢产率的影响 分别加入2.0%的不同碳源到基础发酵培养基中，比较不同碳源对Z-9菌株发酵液活菌含量和芽孢产率的影响。结果(表3)表明，以玉米粉为碳源时，活菌含量和芽孢产率最高，活菌含量为2.7×108cfu/mL，芽孢产率为84.8%。因此玉米粉为最佳碳源。

表3 不同碳源对Z-9菌株活菌含量和芽孢产率的影响

2.1.2 氮源对Z-9菌株发酵液活菌含量及芽孢产率的影响 分别加入1.0%的不同氮源到已确定最佳碳源的基础发酵培养基(玉米粉2.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl2·2H2O 0.02%)中，比较不同氮源对Z-9菌株发酵液活菌含量和芽孢产率的影响，结果(表4)表明，黄豆饼粉为氮源时，活菌含量和芽孢产率最高，活菌含量为7.8×108cfu/mL，芽孢产率为86.6%。因此黄豆饼粉为最佳氮源。

表4 不同氮源对Z-9菌株活菌含量和芽孢产率的影响

2.1.3 无机盐对Z-9菌株发酵液活菌含量及芽孢产率的影响 分别加入0.02%的不同无机盐到已确定最佳碳源、氮源的基础发酵培养基(玉米粉2.0%、黄豆饼粉1.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%)中，比较不同无机盐对Z-9菌株摇瓶发酵液活菌含量和芽孢产率的影响。结果(表5)表明，无机盐为MnSO4·H2O时，活菌含量和芽孢产率最高，活菌含量为11.2×108cfu/mL，芽孢产率为94.1%，MgSO4·7H2O次之。因此选取MnSO4·H2O和MgSO4·7H2O作为考察因子。

表5 不同无机盐对Z-9菌株活菌含量和芽孢产率的影响

2.2 培养基和培养条件正交试验结果

2.2.1 培养基组成正交试验结果 据各单因素试验确定的最适碳源、氮源、无机盐，进行L9(34)正交试验，结果见表6。由表6可知，培养基组分最优组合为A1B2C2D2，即玉米粉1.0%、黄豆饼粉2.0%、MnSO4·H2O 0.04%、MgSO4·7H2O 0.04%。由R值可以看出，RB>RD>RA>RC，说明氮源和无机盐Ⅱ对芽孢数量影响较大。理论的最佳组合恰为试验中的2号组合，芽孢数量和芽孢产率在各组合中均最高，分别为13.92×108cfu/mL和92.8%。因此选用2号组合培养基：玉米粉1.0%、黄豆饼粉2.0%、MnSO4·H2O为0.04%、MgSO4·7H2O为0.04%、Na2HPO4·2H2O 0.4%、NaH2PO4·2H2O 0.2%。

2.2.2 培养条件正交试验结果 在确定了最佳培养基成分及浓度后，又对其发酵工艺参数进行了正交设计，试验结果见表7。由表7可以看出，发酵条件最佳组合为A2B2C3D2，即发酵时间为36 h、250 mL三角瓶装液量50 mL、pH值7.5、温度37 ℃。R值大小为：RB>RC>RD>RA，说明装液量和pH值对芽孢数量影响比较大。理论组合在试验中没有出现，所以需要和5号组合进行对比验证试验。验证试验结果表明，理论组合芽孢数量为1.60×109cfu/mL，5号组合芽孢数量为1.43×109cfu/mL，理论组合比5号组合增加11.9%；芽孢产率达96.5%,比5号组合提高了1.3%。因此，确定最佳培养条件为发酵时间36 h、250 mL三角瓶装液量50 mL、pH值7.5、温度37 ℃。

表6 培养基组成正交试验结果

表7 培养条件正交试验结果

3 结论与讨论

本试验明确了小麦全蚀病菌拮抗菌株BacillusmethylotrophicusZ-9的最佳产芽孢条件，其中培养基组分为：玉米粉1.0%、黄豆饼粉2.0%、MnSO4·H2O为0.04%、MgSO4·7H2O为0.04%、Na2HPO4·2H2O 0.4%、NaH2PO4·2H2O 0.2%；培养条件为：初始pH值7.5，250 mL三角瓶装液量50 mL，37 ℃培养36 h。优化后芽孢数量为1.60×109cfu/mL，比优化前(1.09×108cfu/mL)提高了13.7倍，芽孢产率从72.6%提高到96.5%，为进一步的小试和中试奠定了基础。

本试验优化后最佳碳源、氮源分别为玉米粉、黄豆饼粉，这与张冬冬等[14]对棉花黄萎病生防芽孢杆菌Z-5菌株发酵培养基优化的结果一致，这些不仅都是天然培养基，而且有利于工业生产成本的降低。无机盐Mn2+、Mg2+能提高芽孢产率和活菌含量，明显优于其他金属离子。其中Mn2+在皮层生物合成的相关酶活性和(或)基因表达中发挥作用，本研究结果与徐世荣等[15]所报道的在形成芽孢的培养基中添加Mn2+能使芽孢的得率提高一致。

[1] 全鑫,薛保国,杨丽荣,等.河南省小麦全蚀病菌的分离及变种类型鉴定[J].植物病理学报,2014,44(2):139-146.

[2] 刘正坪,王立新,李荣禧,等.内蒙古巴彦淖尔盟小麦全蚀病菌变种类型初步鉴定[J].华北农学报,2001,16(4): 132-135.

[3] 葛昌斌,秦素研,张兰,等.小麦全蚀病药剂防治试验[J].山西农业科学,2012,40(12):1299-1301.

[4] Gardner P A,Angus J F,Pitson G D,etal.A comparsion of six methods to control take-all in wheat[J].Australian Journal of Agricultural Research,1998,49(8): 1225-1240.

[5] James C R.Take-all of wheat[J].Physiological and Molecular Plant Pathology,2003,62: 83-86.

[6] 连翠飞,李社增,晁春燕,等.产植物激素拮抗细菌CX-5-2的筛选、鉴定及其特性研究[J].植物病理学报,2007,37(2): 197-203.

[7] 王刚,杨之为.荧光假单胞杆菌P2-5菌株对小麦全蚀病的抑制作用[J].植物保护,2004,30(4): 32-34.

[8] 罗晶,张鑫,黄海,等.解淀粉芽胞杆菌Ba-168菌株对小麦全蚀病的防治及其机制[J].植物保护学报,2013,40(5): 475-476.

[9] 全鑫,杨艳艳,杨丽荣,等.利用响应面法优化全蚀病生防菌YB-81的发酵条件[J].天津农业科学,2014,20(9):57-61.

[10] Cho S J,Lee S K,Cha B J,etal.Dectection and characterization of theGloeosporiumgloeosporioidesgrowth inhibitory compound iturin A fromBacillussubtilisstrain KS03[J].FEMS Microbiology Letters,2003,223(1): 47-51.

[11] 秦艳,李卫芬,余东游.蜡样芽孢杆菌发酵条件的优化[J].饲料工业,2008,29(2): 34-37.

[12] 王振海,姜军坡,王选,等.猪源益生菌株BacillusvelezensisZ-27产芽孢发酵条件优化[J].饲料工业,2011,32(12): 40-44.

[13] 张冬冬,雷白时,朱宝成,等.小麦全蚀病生防芽孢杆菌对玉米秸秆的降解及抗菌谱检测[J].河北农业大学学报,2014,37(2): 65-70.

[14] 张冬冬,姜军坡,朱宝成.棉花黄萎病生防芽孢杆菌Z-5菌株发酵培养基的优化[J].棉花学报,2014,26(1): 10-17.

[15] 徐世荣,陈骧,吴云鹏.细胞芽孢形成机制在微生态制剂生产中的应用[J].食品与生物技术学报,2007,26(4): 121-126.

Conditions Optimization for Spore Production of Antagonistic Bacterium

BacillusmethylotrophicusZ-9 against Wheat Take-all Disease

KONG Shaoyuan,LÜ Jitao,ZHANG Dongdong*,WANG Shiying*

(College of Life Science,Agriculture University of Hebei,Baoding 071000,China)

Significant antagonistic activity of strainBacillusmethylotrophicusZ-9 against wheat take-all disease was shown.In order to optimize spore production conditions of the strain Z-9,researches were done by single-factor tests and orthogonal tests with number of viable cells and spore production rate as indexes.The best carbon source,nitrogen source and inorganic salt were corn flour,soybean meal,and MnSO4·H2O,MgSO4·7H2O,respectively,by the single factor experiments.The optimum medium components were determined as corn flour 1.0%，soybean meal 2.0%,MnSO4·H2O 0.04%,MgSO4·7H2O 0.04%,Na2HPO4·2H2O 0.4%,NaH2PO4·2H2O 0.2%,and the optimum fermentation conditions were determined as initial pH value of 7.5,medium volume of 50 mL in 250 mL flask,cultivating at 37 ℃ for 36 h by the orthogonal experiments.The spore yield reached 1.60×109cfu/mL,which was improved by 13.7 times,compared to the result before optimization,and the spore production rate reached 96.5% under the optimum conditions.

wheat take-all disease; antagonistic bacterium;Bacillus; spore; fermentation conditions; optimization; spore production rate

2015-09-18

河北省科学技术研究与发展计划项目(11220313)

孔少元(1989-)，男，河北邢台人，在读硕士研究生，研究方向：农业微生物学。E-mail:25038926@qq.com

*通讯作者：王世英(1963-)，男，河北安平人，教授，本科，主要从事农牧微生物学研究。E-mail:wsy99999@126.com 张冬冬(1981-)，男，河北保定人，副教授，在读博士研究生，主要从事植物土传病害的生物防治研究。 E-mail:zhangdongcumt@163.com

S435.121;TQ920.6

A

1004-3268(2016)01-0088-04