鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

王安平，朱善元，吴 双，王永娟，左伟勇，洪伟鸣

(江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏 泰州 225300)

鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

王安平，朱善元*，吴 双，王永娟，左伟勇，洪伟鸣

(江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏 泰州 225300)

为制备鸭源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗体，根据鸭新城疫病毒M基因序列设计1对特异性引物，RT-PCR方法扩增出M基因，克隆入原核表达载体pET-30a，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG的诱导下成功表达重组蛋白，SDS-PAGE结果显示，表达的重组蛋白分子质量约为39 ku。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠，制备重组蛋白的多抗血清，Western blot分析显示，制备的多抗血清能与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明，M基因在大肠杆菌中获得了成功表达，且制备的鼠多抗血清可以用于M蛋白的检测。

鸭新城疫病毒；M基因； 原核表达； 多抗

新城疫俗称亚洲鸡瘟、伪鸡瘟，是由新城疫病毒(NDV)强毒株引起的侵害鸡、火鸡等250多种禽类的一种急性、高度接触性传染病，主要特征是病禽呼吸困难、高热、下痢、神经机能紊乱、黏膜和浆膜出血[1-3]。以往认为NDV不会引起水禽致病，自1997年王永坤等[4]报道从病鹅体内分离到了NDV强毒株，NDV对水禽不致病之说被打破。近年来，鸭、鹅等水禽感染NDV并发病的报道越来越多，给我国水禽养殖业带来的损失也越来越严重[5-7]。

NDV是单股负链、不分节段的RNA病毒，基因组编码6种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白(NP)、膜蛋白(M)、磷酸化蛋白(P)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)、融合蛋白(F)和大分子蛋白(L)。其中，M蛋白是NDV囊膜上除F、HN蛋白之外的蛋白质，由364个氨基酸残基组成，是非糖基化膜相关蛋白，具有疏水性，但不是跨膜蛋白，位于病毒囊膜内侧面，一部分镶嵌在囊膜内，另一部分与核衣壳相互作用，构成囊膜的支架。研究报道，M蛋白不仅在病毒的装配中发挥重要作用，而且在调节病毒RNA合成、抑制宿主细胞的免疫应答等方面也扮演着重要角色[8-9]。目前，关于鸭NDV的研究主要集中在F、NP蛋白新型疫苗的开发等方面，而关于M蛋白在NDV致病性和免疫原性中的作用研究尚不多见。本研究利用pET原核表达系统表达鸭NDV的M基因，切胶纯化重组蛋白，免疫小鼠制备其多抗血清，为进一步研究M蛋白的免疫原性及相关试剂盒的研发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 毒株、菌株和载体

鸭NDV强毒株由福建省农业科学院惠赠；9日龄SPF鸡胚购于江苏农牧科技职业技术学院国家水禽基因库；pET-30a载体、大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞均由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室制备并保存。

1.2 酶和相关试剂

Trizol试剂盒购自大连TaKaRa公司；M-MLV反转录酶购自美国Invitrogen公司；限制性核酸内切酶NdeⅠ、XhoⅠ和T4 DNA连接酶购于Fermentas公司；His组氨酸单抗、HRP-羊抗鼠IgG、DAB显色试剂盒购于康为世纪公司；质粒小提试剂盒、DNA胶回收试剂盒购于爱思进公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中公布的鸭NDV病毒基因组序列，设计了1对针对M基因序列的引物，并在上游引入NdeⅠ酶切位点，下游引入XhoⅠ酶切位点，引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。引物序列为M-F: 5′-GACCATATGGACTCATCCAGGACAATCGG-3′(下划线为NdeⅠ酶切位点)；M-R:5′-GCGCTCGAGTTATTTCCTGAAAGGATTG-3′(下划线为XhoⅠ酶切位点)。

1.4 病毒的增殖与RNA的提取

将NDV原代病毒10倍稀释后，取0.2 mL接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔，38 ℃孵化箱孵化。剔除24 h内死亡的鸡胚，选择48～72 h死亡的鸡胚，置于4 ℃过夜，收集尿囊液。按Trizol法抽提尿囊液总RNA，-80 ℃保存备用。

1.5M基因的扩增和测序

根据Invitrogen公司的RT-PCR试剂盒操作说明进行操作，反转录PCR反应程序为：25 ℃，10 min；42 ℃，90 min；70 ℃，10 min。 PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；然后95 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 重组质粒载体pET-M的构建

将PCR 产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离后，参照DNA回收试剂盒说明书切胶回收目的条带，然后经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切回收后，与同样经NdeⅠ、XhoⅠ酶切的pET-30a连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含100 μg/mL卡那霉素(Kan)的LB 琼脂平板上37 ℃培养过夜，随机挑取单菌落，提取质粒，电泳筛选出疑似菌落，进一步用NdeⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。酶切鉴定正确的重组质粒送上海英潍捷基生物技术有限公司测序，测序正确的重组质粒命名为pET-M。

1.7 重组菌的诱导表达

将鉴定正确的重组质粒pET-M转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑取单菌落接种于新鲜的含Kan抗性的LB 液体培养基中，37 ℃ 培养过夜，次日按 1∶100 的比例转接至5 mL含Kan的 LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至菌液OD600值达0.6～0.8，加入 IPTG 至终浓度在0.2～1.0 mmol/L，37 ℃ 继续振荡培养3～5 h，离心收集菌体，沉淀溶于适量PBS中，超声波裂解后离心，分别收集上清及沉淀，进行SDS-PAGE分析。以相同条件下诱导含pET-30a空载体的菌液作为空白对照。

1.8 重组蛋白抗血清的制备

将重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，1 mol/L KCl染色，切出目的条带，加入适量PBS研磨均匀，以皮下两点注射法免疫8周龄ICR小鼠，每隔2周注射1次，4次免疫后第10天采血，分离血清，至-80 ℃保存备用。

1.9 多抗血清的Western blot 鉴定

将鸭NDV鸡胚尿囊液进行SDS-PAGE，然后转印至PVDF膜，用5%的脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，以制备的鼠多抗血清作为一抗，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠为二抗，DAB显色试剂盒进行显色。同时以未接种NDV鸡胚尿囊液作为阴性对照。

2 结果与分析

2.1M基因的克隆及重组质粒pET-M酶切鉴定

以提取的尿囊液总RNA为模板，RT-PCR扩增出约1 100 bp的目的条带，与理论值相符。重组质粒经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切后获得约1 100 bp和5 400 bp 2个条带(图1)，与预期结果相符，且进一步的测序结果表明，克隆的M基因序列(1 095 bp)及阅读框完全正确。

2.2 重组蛋白的诱导表达与检测

将pET-M重组菌诱导产物进行SDS-PAGE分析，并以空载体转化菌作为阴性对照。结果表明，重组蛋白的分子质量约为39 ku(图2)，并均以包涵体形式存在。

M:DNA分子质量标准； 1:pET-M的NdeⅠ和XhoⅠ双酶切； 2:M基因PCR产物图1 M基因克隆及重组质粒pET-M的酶切鉴定结果

M:蛋白质分子质量标准； 1:E.coli/pET-30a IPTG诱导； 2:E.coli/pET-M IPTG诱导图2 M重组蛋白的SDS-PAGE分析结果

2.3 多抗血清的Western blot鉴定

以纯化的融合蛋白原核表达产物免疫ICR小鼠，制备M蛋白的多抗血清，获得的血清能与NDV鸡胚尿囊液反应，条带大小约为39 ku(图3)，与M蛋白大小相符。

M:蛋白质分子质量标准; 1:NDV尿囊液; 2:SPF鸡胚正常尿囊液图3 M蛋白多抗血清的Western blot 鉴定结果

3 结论与讨论

M蛋白是NDV中除HN和F蛋白之外的又一重要致病因子，是病毒粒子的包装中必不可少的成分[10-11]。目前，对鸭NDV的研究多集中于F和HN蛋白，对M蛋白的免疫原性及在病毒复制和致病性中的作用研究还不多见，利用原核表达系统对M蛋白进行体外表达和多抗制备，对深入研究M蛋白的功能和NDV的致病性具有重要意义。相对于繁琐的病毒纯化来讲，利用成熟的原核表达系统获得病毒蛋白相对比较容易简便。pET表达系统是目前使用较为广泛的一种原核表达系统，在诱导状态下宿主菌内几乎所有的资源都可以转向目的基因的表达，外源基因的表达量一般可以达到菌体总蛋白的30%以上。本试验用pET-30a表达系统成功表达了鸭NDV M蛋白，采用RT-PCR技术扩增出完整的M基因，序列分析表达克隆的M基因长为1 095 bp， SDS-PAGE电泳和Western blot分析证明，表达的融合蛋白分子质量约为39 ku，与预期结果相符，说明表达的重组蛋白大小正确。

pET原核系统表达的外源蛋白缺少翻译后加工功能，但表达产物依旧保持了良好的免疫原性。本试验结果也证明了这一点，利用表达的融合蛋白经KCl染色切胶纯化后，免疫小鼠制备了针对重组蛋白的多抗血清，Western blot分析说明，制备的多抗血清可与NDV尿囊液中的M蛋白发生特异性反应，充分说明制备的多抗血清具有良好的反应特异性，可以作为检测用抗体进一步用于NDV M抗原的检测及功能研究。下一步有必要将目的蛋白进行纯化，并切除标签蛋白，以增强抗原及制备抗体的特异性。

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Prokaryotic Expression and Antiserum Preparation of theMGene of Duck NDV

WANG Anping,ZHU Shanyuan*,WU Shuang,WANG Yongjuan,ZUO Weiyong,HONG Weiming

(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College/Jiangsu Province Key Laboratory of Veterinary Bio-pharmaceutical High-tech Research,Taizhou 225300,China)

In order to express M protein of duck-origin Newcastle disease virus and prepare polyclonal antibodies,according to the genome sequences of duck NDV,one pair of specific primers was designed.TheMgene was amplified by RT-PCR,and then was cloned into prokaryotic expression vector pET-30a,and the recombinant plasmids were transformed into BL21(DE3)E.coli.Then the recombinant proteins were successfully expressed following IPTG induction,SDS-PAGE showed that the approximate molecular weight of recombinant expression proteins was 39 ku.The antiserum against the recombinant proteins were produced by immunized ICR mouse with recombinant proteins.Western blot results showed that the antiserum could react specifically with NDV allantoic fluid.These results showed thatMgene was successfully expressed inE.coli,and the antiserum could be used for detection of M proteins,and these lay the foundation for the development of detection kit.

duck NDV;Mgene; prokaryotic expression; antiserum

2015-07-02

国家自然科学基金项目(31302096);江苏省农业支撑项目(BE2013415);江苏省六大人才高峰项目(NY-009)

王安平(1980-)，女，江苏泰州人，副教授，博士，主要从事兽用生物制药方面的研究。E-mail:wap4017@163.com

*通讯作者：朱善元(1968-)，男，江苏泰州人，教授，博士，主要从事分子生物学方面的研究。E-mail：jstzzsy@126.com

S855.3

A

1004-3268(2016)01-0124-03