胰升糖素样肽-1受体激活对高糖诱导心肌肥大的抑制作用及其机制

陈 东 廖 伟

(赣南医学院，江西 赣州 341000)

胰升糖素样肽-1受体激活对高糖诱导心肌肥大的抑制作用及其机制

陈 东 廖 伟1

(赣南医学院，江西 赣州 341000)

目的探讨胰升糖素样肽(GLP)-1受体激活对高糖诱导心肌肥大的抑制作用及其机制。方法 体外培养大鼠心肌细胞H9C2，将生长状态良好的细胞随机分为正常对照组(N组)，高糖组(H组)，高糖+Exendin-4组(E组)。干预48 h后采用Western 印迹法分别检测各组细胞中心纳素(ANP)、β-组织相容性复合体(MHC)、GLP-1、转化生长因子(TGF)-β1、骨桥蛋白(OPN)表达情况。结果 高糖组ANP、β-MHC、TGF-β1、OPN蛋白表达较正常对照组明显增高；Exendin-4干预后ANP、β-MHC、TGF-β1、OPN蛋白表达降低，但仍高于正常对照组。高糖组GLP-1蛋白表达较正常对照组明显降低，Exendin-4干预后GLP-1蛋白表达增加，但仍低于正常对照组。结论 GLP-1受体激活可能是通过激活GLP受体，抑制TGF-β1、OPN的表达，从而在抗高糖诱导的心肌细胞肥大过程中起重要作用。

胰升糖素样肽；高糖；心肌肥大；骨桥蛋白；转化生长因子β

胰升糖素样肽-1(GLP-1)是一种由肠黏膜L细胞分泌的肠促胰岛素，不仅具有改善血糖控制的生理功能，还具有抗心肌细胞肥大、凋亡和抗纤维化的作用〔1〕。糖尿病心肌病的主要病理特征是心肌细胞肥大以及心肌间质纤维增生。研究证实高血糖和高胰岛素是促进心肌肥厚的独立因素〔2〕，高糖可诱导体外培养的心肌细胞肥大。本研究探讨GLP-1受体激动剂Exendin-4对高糖诱导心肌肥大的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂 大鼠心肌细胞株H9C2购自中国科学院细胞库。β-组织相容性复合体(β-MHC)抗体购自abcom公司；心纳素(ANP)、GLP-1、辣根过氧化物酶抗体、HRP 标记的辣根过氧化酶二抗购自ABclonal公司；转化生长因子(TGF)-β1抗体购自Bioss公司；β-actin抗体购自中山金桥公司。Exendin-4购自Sigma公司。胎牛血清购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司。DMEM、胰酶、磷酸盐缓冲液(PBS)、DMSO、RIPA 裂解液购自索莱宝公司。BCA 蛋白定量试剂盒购自碧云天。增强型化学发光(ECL)显影液购自天根公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM 培养液培养细胞，隔天换液1次，待细胞长至约占培养皿90%时，用PBS冲洗两遍，加数滴0.25%胰酶，消化1～2 min，加含血清培养液终止消化，用枪头轻轻吹打使细胞脱落，离心、重悬后按1传3的比例分到新皿。

1.2.2 实验分组 取状态良好的细胞传代进行实验分组，随机分为以下三组：①正常对照组(N组)：葡萄糖浓度为5.5 mmol/L；②高糖组(H组)：葡萄糖浓度为25.0 mmol/L；③高糖+Exendin-4(E组)：Exendin-4终浓度为50 nmol/L，葡萄糖浓度为25.0 mmol/L。48 h后行下一步实验。

1.2.3 心肌细胞表面积测定 干预实验结束后，取各组心肌细胞进行图像采集，采用Image-Pro Plus软件分析各组心肌细胞表面积，每组随机取10个视野，每个视野测定10个细胞表面积，以正常对照组为参照，计算各组细胞相对表面积。每组重复5次。

1.2.4 心肌细胞蛋白含量检测 将培养好的心肌细胞用PBS冲洗后，加入RIPA 裂解缓冲液，4℃，15 min 后用细胞刮收集细胞，4℃，12 000 r/min，离心10 min，取上清液，按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒说明书操作，在570 nm波长处检测A值，计算单个心肌细胞蛋白含量(pg/cell)，每组重复5次。

1.2.5 Western印迹检测各蛋白水平 取药物处理48 h后的心肌细胞，冰上裂解细胞并提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度后，调整各组蛋白浓度至相同水平，各组取30～50 μg蛋白，进行十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，转膜，封闭2 h，孵育以相应的一抗4℃过夜〔β-actin、ANP 1∶1 000；GLP-1、骨桥蛋白(OPN)、TGF-β 1∶400〕。孵育过夜后用Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜，而后加入相应HRP标记二抗于室温孵育1 h，再次用TBST洗膜，使用ECL发光并将膜置于暗盒内，压上X光片，在暗室内曝光、显影、漂洗、定影，晾干后对胶片进行拍照，使用Image J软件进行积分光密度分析。结果以β-actin 为内参，计算各组各蛋白的相对表达量。每组重复3次。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行多组间单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间比较采用LSD法。

2 结 果

2.1 GLP-1受体激动剂对高糖诱导心肌肥大的抑制作用 与正常对照组〔心肌细胞表面积(661.84±35.46)μm2/cell,心肌细胞蛋白含量(650.84±44.31)pg/cell,ANP(0.997±0.104)、β-MHC(0.491±0.185)〕相比，高糖组心肌细胞表面积〔(959.88±39.86)μm2/cell〕、心肌细胞蛋白含量〔(948.90±62.05)pg/cell〕及ANP(1.581±0.185)、β-MHC(0.977±0.138)均明显增加(P<0.05)。与高糖组相比，Exendin-4 处理48 h后明显减轻高糖诱导的心肌细胞ANP(1.155±0.107)、β-MHC(0.758±0.173)的表达水平(P<0.01)和心肌细胞相对表面积〔(792.22±53.72)μm2/cell〕(P<0.01)及蛋白含量〔(750.14±48.34)pg/cell〕(P<0.05)。见图1。

图1 各组心肌细胞中ANP和β-MHC蛋白表达水平

图2 各组心肌细胞中GLP-1、TGF-β1和OPN蛋白表达水平

2.2 GLP-1受体激动剂对高糖诱导的心肌肥大细胞GLP-1、TGF-β1和OPN蛋白表达的影响 与正常对照组相比〔TGF-β1:(0.710±0.212),OPN:(0.412±0.195),GLP-1:(2.642±0.102)〕，高糖组TGF-β1(1.178±0.163)和OPN(1.002±0.131)蛋白表达显著上调(P<0.01)，GLP-1蛋白(0.770±0.147)表达降低(P<0.05)。Exendin-4干预可抑制TGF-β1(0.851±0.112)和OPN蛋白(0.857±0.168)的表达(P<0.01)，上调GLP-1蛋白(1.361±0.118)表达(P<0.05)。见图2。3 讨 论

心肌肥大是糖尿病心肌病的突出特征，而高血糖是诱导糖尿病性心肌肥大的主要因素之一〔3〕。本实验表明Exendin-4干预后能减轻高糖诱导的心肌细胞肥大标志物的表达、心肌细胞蛋白含量及细胞面积，表明Exendin-4能抑制心肌肥大。目前认为，糖尿病心肌病心肌纤维化主要因素可能是高血糖导致的氧化应激、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活以及TGF-β1表达增加等〔4〕。本研究提示TGF-β1/OPN信号通路参与心肌肥大过程。TGF-β1在心血管系统中表达广泛，能诱导心肌细胞肥大和心脏成纤维细胞增殖以及细胞外基质的合成，引起心肌细胞肥大及间质纤维化。OPN是一种分泌型磷酸化的糖蛋白，属于细胞外基质蛋白家族，又是一种具有促炎及促纤维化特性等多功能的细胞因子，可与多种配体相结合，发挥相应的生物学效应。正常情况下，心脏OPN表达水平较低，然而在许多病理情况下，如急性心肌梗死后及慢性压力负荷下小鼠心肌细胞OPN表达增强；在心肌肥大时OPN 在心肌细胞中呈高表达状态〔5〕。随着糖尿病心肌病和心衰病程的进展，OPN的表达也明显增多〔6〕。Subramania等〔7〕的研究显示糖尿病小鼠心肌组织OPN表达增加，纤维化程度明显，而敲除OPN基因后，心肌纤维化减轻，凋亡减少，心功能也得到了改善。这些报道与本实验高糖诱导心肌肥大后OPN的表达增多结果相一致，说明OPN参与了高糖诱导心肌肥大的发生发展过程。研究〔8〕发现OPN基因的启动子有TGF-β的结合元件，提示OPN

可受TGF-β的调控。也有文献报道TGF-β1下游信号蛋白Smad3 与OPN 基因启动子结合，Smad4 与阻遏蛋白结合并使之移位，从而促使OPN mRNA转录，OPN 可能是TGF-β1 的下游分子〔9〕。在大鼠肾上皮细胞系NRK52E的研究中发现，TGF-β1可上调OPN基因转录〔10〕。在人肝星状细胞系中TGF-β1通过其下游Runt相关转录因子(RUNX2)作用于OPN 启动子区域促进OPN表达〔11〕。另有报道提示，在哮喘和成骨细胞分化等病理生理过程，OPN都与TGF-β1通路密切相关。但是，也有研究〔12〕显示OPN具有调节TGF-β1 激活作用。

1 Picatoste B，Ramirez E，Caro-Vadillo A，etal.Sitagliptin reduces cardiac apoptosis，hypertrophy and fibrosis primarily by insulin-dependent mechanisms in experimental type-Ⅱ diabetes.Potential roles of GLP-1 isoforms〔J〕.PLoS One，2013；8(10)：e78330.

2 Bell D，McDermott BJ.Effects of rosiglitazone and interactions with growth-regulating factors in ventricular cell hypertrophy〔J〕.Eur J Pharmacol，2005；508(1-3)：69-76.

3 Xu J，Li H，Irwin MG，etal.Propofol ameliorates hyperglycemia-induced cardiac hypertrophy and dysfunction via heme oxygenase-1/signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway in rats〔J〕.Crit Care Med，2014；42(8)：e583-94.

4 Krenning G，Zeisberg EM，Kalluri R.The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis〔J〕.J Cell Physiol，2010；225(3)：631-7.

5 Trueblood NA，Xie Z，Communal C，etal.Exaggerated left ventricular dilation and reduced collagen deposition after myocardial infarction in mice lacking osteopontin〔J〕.Circ Res，2001；88(10)：1080-7.

6 Singh K，Sirokman G，Communal C，etal.Myocardial osteopontin expression coincides with the development of heart failure〔J〕.Hypertension，1999；33(2)：663-70.

7 Subramania V，Krishnamurthy P，Singh K，etal.Lack of osteopontin improves cardiac function in streptozotocin-induced diabetic mice〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007；292(1)：H673-83.

8 He D，Wang S，Jia Z，etal.Calcium ions promote primary renal epithelial cell differentiation into cells with bone-associated phenotypes via transforming growth factor-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in idiopathic hypercalciuria patients〔J〕.Mol Med Rep，2015；11(3)：2199-206.

9 Androulakis E，Tousoulis D，Papageorgiou N，etal.Inflammation in hypertension：current therapeutic approaches〔J〕.Curr Pharm Des，2011；17(37)：4121-31.

10 李 珺，董吉祥.骨桥蛋白与糖尿病肾病〔J〕.国外医学·内分泌学分册，2005；25(2)：126-8.

11 王 睿，萧 笑.TGF-β1通过RUNX2调控人肝星状细胞系LX-2中骨桥蛋白表达〔J〕.现代生物医学进展，2013；13(35)：6801-5.

12 Driver J，Weber CE，Callaci JJ，etal.Alcohol inhibits osteopontin-dependent transforming growth factor-beta1 expression in human mesenchymal stem cells〔J〕.J Biol Chem，2015；290(16)：9959-73.

〔2016-01-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

国家自然科学基金资助项目(No.81360030)

廖 伟(1965-)，男，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事代谢性疾病研究。

陈 东(1990-)，男，在读硕士，主要从事代谢性疾病研究。

R542

A

1005-9202(2016)24-6061-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.006

1 赣州市卫计委