传统发酵食品中微生物多样性和群落结构动态变化研究进展

吴进菊，胡佳琪，于　博，李云捷

（湖北文理学院化学工程与食品科学学院，湖北 襄阳 441053）

传统发酵食品中微生物多样性和群落结构动态变化研究进展

吴进菊，胡佳琪，于博，李云捷

（湖北文理学院化学工程与食品科学学院，湖北 襄阳 441053）

传统发酵食品制作和食用历史悠久，其中蕴藏了丰富的微生物资源。随着分子生物学技术的不断发展，可从基因水平上全面揭示传统发酵食品中微生物的多样性和群落结构的动态变化，阐明其发酵机理，对今后传统发酵食品的工业化、标准化生产和益生菌的开发利用具有极其重要的意义。

传统发酵食品；微生物多样性；群落结构；动态变化

传统发酵食品制作和食用历史悠久，发酵系统开放，蕴藏了丰富的微生物资源，经过长期的演化过程，保留了大量优良的微生物资源。近年来，传统发酵食品中微生物的多样性和群落结构动态变化引起了国内外学者的高度重视，纷纷开展相关研究工作，取得了较大的研究成果。本文主要介绍传统发酵食品中微生物多样性的研究方法以及研究进展，比较传统的纯培养方法和非培养的基于宏基因组学理论方法的优劣性，并介绍我国传统发酵食品中微生物多样性的研究进展，如发酵乳制品、发酵果蔬、发酵酒饮料和发酵豆制品等。通过对传统发酵食品中微生物多样性和群落结构变化的研究，可以揭示其发酵机理，对今后传统发酵食品的工业化、标准化生产和益生菌的开发利用具有极其重要的意义。

1　传统发酵食品中微生物多样性的研究方法

1.1传统纯培养方法

传统纯培养方法一般是先对微生物进行分离纯化，然后对分离菌株进行种属鉴定。任晓镤等［1］研究了新疆民族特色酸奶及酸奶疙瘩中乳酸菌的多样性，结果表明，戊糖乳杆菌和副干酪乳杆菌为优势菌种。ROSANNA T等［2］研究了意大利传统发酵橄榄中酵母菌的多样性，分离出117株酵母菌，其中87株属于啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae），其余的为毕赤酵母（Pichiagaleiformis）、假丝酵母（Candida）等。另外，该方法也被用于研究土耳其传统果汁饮料gilaburu［3］、印度传统发酵豆制品tungrymbai和bekang［4］、云南山羊奶糕［5］的多样性研究。该方法可以检测到在培养基中生长的微生物，对于不能在培养基上生长的微生物无法进行分析。

1.2PCR-DGGE技术

近年来分子生物学和生物信息学发展迅速，越来越多的研究者开始应用这些不可培养的技术对传统发酵食品中的微生物多样性进行分析，如脱氧核糖核酸（deoxyribose nucleicacid，DNA）克隆和序列测定、高通量测序技术、基因芯片技术、基于聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）的各种指纹图谱技术等。其中聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术广泛应用于发酵食品中微生物多样性的分析［6］。DGGE技术是利用聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度不同，将不同组成和排列的DNA序列分开。PCR-DGGE技术是先采用PCR将目的基因进行扩增，然后采用DGGE技术对PCR扩增产物进行分离得到指纹图谱，通过测序、序列比对对指纹图谱中的条带进行物种鉴定［7］。DOAN T L N等［8］利用PCR-DGGE技术研究了越南发酵蔬菜中乳酸菌的多样性，其中发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）占56.6%，戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）占24.4%，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）占17.1%，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）占1.0%，短乳杆菌（Lactobacillus brevis）占0.5%。LIU W J等［9］从我国内蒙古东部地区采集的198份酸牛奶样品中分离出790株乳酸菌，经过生理生化分析、16S rRNA基因序列分析、DGGE等手段分析，鉴定出31个种和亚种。DEVI K R等［10］利用PCRDGGE技术研究了印度东北部传统发酵干鱼ngari细菌动态分析。另外，PCR-DGGE技术还用于东北酸菜［11］、巴西发酵饮料chicha［12］、意大利salami香肠［13］、西非谷类食品［14］、干酪［15］等微生物研究中。PCR-DGGE技术稳定性高、重现性强、效率高，能够弥补传统方法分析微生物群落的不足和局限性，但是灵敏度不高，只能检测出环境中的优势微生物，而低丰度微生物很难检出，往往会偏低估计样品中的微生物信息，不能全面的反应微生物的多样性。

1.3高通量测序技术

高通量测序技术是DNA测序发展历程的一个里程碑，也称为二代测序技术，可一次性对几十万到几百万条DNA分子进行并行测序，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志。454技术是基于焦憐酸测序原理建立起来的测序系统，其主要原理是：利用特别设计的DNA捕获磁珠与独特的短DNA片段结合，采用扩增试剂乳化，形成只包含一个磁珠和一个独特DNA片段的微反应体系，DNA片段在微反应体系中发生扩增，乳化体系被打破，然后将携带有PCR产物的磁珠进行测序。将A、T、G、C 4种碱基依次加入反应板中，如果发生碱基配对就会释放一个焦磷酸，焦磷酸在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）硫酸化酶和荧光素酶的作用下发出光信号。通过对光信号的捕获和分析，可以快速、准确地获得待测DNA的碱基序列。Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术与焦磷酸测序法的原理类似，都是进行边合成边测序，也就是生成新DNA互补链时，加入的脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）通过酶促级联反应催化底物产生相应荧光，或直接加入被荧光标记的dNTP，利用其释放的荧光信号，获得互补链序列信息［16］。高通量测序技术效率高，可以在一次测序试验中完成多个样本的检测，获得海量序列，灵敏度高，不仅能检测出优势微生物，对于低丰度微生物也能检出，能全面、准确的揭示环境中微生物的多样性。高通量测序技术已被广泛用于发酵食品中，如干酪［17-18］、啤酒［19］、黄酒［20］、发酵豆制品［21-23］、香肠［24］、发酵蔬菜［25-26］、发酵饮料［27］等。

HIROSHI O等［25］利用焦磷酸测序技术对日本Nukadok（糠床，用于米糠腌制发酵蔬菜的基床）微生物多样性和群落动态结构动态变化进行了研究，在发酵的第一个星期检出大量种类的微生物而乳酸菌没有检出，随后微生物种类数量急剧减少，而乳酸菌种类显著增加，植物乳杆菌为优势菌种。而利用纯培养技术只检出了发酵过程中的优势菌种，并且在发酵后期连优势菌株种都未检出。JUSTYNA Y J等［23］比较了Illumina高通量测序技术、PCR-DGGE技术、传统纯培养技术在意大利salami香肠微生物多样性研究中的优劣性，研究表明PCR-DGGE技术只鉴定出了腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcusxylosus）、清酒乳杆菌（Lactobacillussakei），而Illumina高通量测序技术不仅鉴定出了这几个种属，对丰度较低的微生物种属也能发现。另外，PATRICIA E等［27］比较了传统培养方法和454焦磷酸测序技术在阿根廷发酵饮料chicha中微生物多样性的研究，NAM Y D等［22］比较了454焦磷酸测序和DGGE在韩国发酵豆制品cheonggukjang中微生物多样性的研究，均得出了相同的结论，高通量测序技术在研究微生物多样性和群落结构动态变化方面均优于传统纯培养方法和PCR-DGGE技术。

2　我国传统发酵食品中微生物多样性的研究进展

2.1发酵乳制品中微生物多样性的研究进展

发酵乳制品是新疆、西藏等地区传统的发酵食品，包括酸牛乳、酸牦牛乳、酸奶油、酸奶疙瘩等。LIU W J等［28］研究表明西藏地区酸牦牛乳中优势乳酸菌为瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus），而发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）检出频率较低，德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）出现频率较高。李艳等［29］对自然发酵乳及传统开菲尔粒中酵母菌的多样性进行了研究，结果表明马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）为优势菌群，具有酿造低酒度发酵乳的潜力。西藏地区传统发酵酸牛乳中富含乳酸菌和酵母菌，以乳酸菌为优势菌群，平均数量达到106CFU/mL，酵母菌平均数量为105CFU/mL。微生物数量的差异可能和当地的地理位置、气候及制作条件如接种量、接种时间、发酵温度等因素有关［30］。

2.2发酵果蔬中微生物多样性的研究进展

佟婷婷［31］对采集的20个四川农家自制泡菜样品中感官评分较高的3个样品进行细菌多样性分析，结果显示四川泡菜中以乳杆菌属（Lactobacillus）为主，占比达到76%～89%，是老坛中的优势菌，而泡菜发酵中启动菌为魏斯氏菌属（Weissella），含量达到74.5%。荆雪娇等［32］对市售9种发酵蔬菜中细菌群落多样性分析、主成分聚类分析和优势条带的序列分析，包括泡菜、榨菜、酱菜和酸菜，结果表明不同加工工艺对发酵蔬菜的多样性和群落结构有显著影响，相同工艺的发酵蔬菜样品，细菌多样性指数差异不大，主成分聚类分析聚为一类，乳杆菌为发酵蔬菜优势菌群。对于泡菜，萝卜、豇豆、青菜和榨菜四种不同原料泡菜样品中优势菌均包含德巴利氏酵母属（Debaryomyces），并且萝卜和青菜泡菜水样品的真菌多样性较低，豇豆和榨菜泡菜水样品真菌多样性指数较高［33］。

2.3发酵酒饮料中微生物多样性的研究进展

中国白酒和黄酒有着悠久的酿造历史，口感独特，其中白酒被誉为世界六大蒸馏酒之一。传统的中国白酒和黄酒酿造是一个相对比较开放的系统，参与的微生物种类众多，现代分子生物学手段可以有效地帮助人们了解其中蕴藏的微生物资源。WANG P等［20］对绍兴黄酒发酵过程中的细菌群落结构动态变化进行了研究，共发现了12个种属的细菌，包括乳杆菌（Lactobacillus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞菌（Pseudomonas）、葡萄球菌（Staphylococcus）、魏斯氏菌（Weissella）、乳球菌（Lactococcus）、肠球菌（Enterococcus）、水栖菌（Enhydrobac ter）等，其中乳杆菌、糖多孢菌属于优势菌。在发酵第3天，乳杆菌占细菌总数的12.020%，明显低于糖多孢菌（23.897%），而在随后的发酵过程中，乳杆菌的比例明显高于糖多孢菌，在发酵第10天时达到最高，为44.723%。LV X C等［34］对乌衣红曲黄酒发酵过程中的微生物多样性进行了研究，结果表明，发酵初期优势菌为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和芽孢杆菌（Bacillus），在发酵过程中优势菌为芽孢杆菌（Bacillus）和乳杆菌（Lactobacillus）。

ZHANG X等［35］采用焦磷酸测序对清茬、后火、红心3种清香型中国白酒大曲进行了多样性分析，在97%相似度情况下香浓指数分别为5.0、4.2和4.2，表明清茬的生物多样性最高。另外，叶光斌等［36-37］分别对四川泸州、贵州、四川宜宾等地区白酒窖泥中的微生物多样性进行了研究，发现其优势种群分别为梭菌纲细菌（Clostridia）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformi）、梭状芽孢杆菌（Clostridium）。

2.4发酵豆制品中微生物多样性的研究进展

柳陈坚等［38］对云南省普洱市豆豉中微生物群落多样性进行了分析，结果表明豆豉中的细菌都属于厚壁菌门（Firmicutes），主要的优势细菌是嗜盐四联球菌（Tetrageno coccus halophilus），其次是葡萄球菌属（Staphylococcus），真菌都属于假丝酵母属（Candida）。而云南省玉溪豆豉中乳酸杆菌（Lactobacillus）是丰度最高的细菌，占总序列数的72%，在豆豉发酵中起重要作用；芽孢杆菌（Bacillus）也是重要的细菌，占序列总数的10%［39］。四川郫县传统自然发酵豆瓣在发酵中期（5个月）优势菌为芽孢杆菌（Bacillus）、假丝酵母（Candida）和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces），成熟期（10个月）优势菌为芽孢杆菌（Bacillus）、海洋芽孢杆菌（Oceanobacillus）［40］。酱油酱醅中的乳酸菌以魏斯氏菌（Weissella）为主，在发酵8d的样品中，魏斯氏菌（Weissella）占61%，库特氏菌（Kurthia gibsonii）占11%，芽孢杆菌（Bacillus）只占检测到细菌的6%；发酵16 d时魏斯氏菌（Weissella）降为42%，库特氏菌（Kurthia gibsonii）和芽孢杆菌（Bacillus）则占比上升，分别达到25%；发酵25 d时只检测到芽孢杆菌（Bacillus）的存在，而其他的细菌菌群都没有被检测到［41］。

3　展望

传统发酵食品中微生物多样性非常丰富，并蕴藏了丰富的益生菌资源。针对传统发酵食品中微生物多样性，早期的研究基本是建立在传统纯培养技术研究方法上的，只能获得微生物总量中极少的一部分，存在很大的局限性和片面性，从而对发酵过程中微生物群落结构变化、种群多样性和微生物功能多样性了解不够清楚。随着科技的发展，分子生物学手段逐渐取代传统纯培养方法用于微生物多样性的研究，它可从基因水平上全面揭示传统发酵食品中微生物的多样性和群落结构的动态变化，避免了基于纯培养的传统方法的局限性，是目前研究微生物多样性常用的方法。

目前，我国很多传统发酵食品的生产依然在沿用传统的工艺，存在很多的问题，如生产规模小，生产工艺落后，乳酸发酵缓慢，发酵周期较长，受环境因子影响很大，使产品质量很不稳定，存在一定的食品安全隐患等，因此制约了传统发酵食品的发展。通过对传统发酵食品中微生物多样性和群落结构变化的研究，可以揭示其发酵机理，获得优势菌群，开发自然微生物资源，对今后传统发酵食品的工业化、标准化生产和益生菌的开发利用具有极其重要的意义。

［1］任晓镤，妥彦峰，梁月慧，等.新疆民族特色酸奶及酸奶疙瘩中乳酸菌的分离鉴定及其生物膜形成能力检测［J］.塔里木大学学报，2014，26（4）：1-7.

［2］ROSANNA T，GIORGIA P，MARIA S，et al.Yeast biota associated to naturally fermented table olives from different Italian cultivars［J］.Int J Food Microbiol，2013，161（3）：203-208.

［3］OSMAN S，ISMET O，NURDAN Y，et al.Diversity and probiotic potentials of lactic acid bacteria isolated from gilaburu，a traditional Turkish fermented European cranberrybush（Viburnum opulusL.）fruit drink［J］. Food Res Int，2014，64：537-545.

［4］RAJEN C，JYOTI P T.Bacillus species isolated from tungrymbai and bekang，naturally fermented soybean foods of India［J］.Int J Food Microbiol，2015，197：72-76.

［5］BAO Q H，CHEN X，LIU H X，et al.Isolation and identification of cultivable lactic acid bacteria from traditional goat milk cake in Yunnan province of China［J］.Afr J Microbiol Res，2011，29（5）：5284-5291.

［6］COCOLIN L，ALESSANDRIA V，DOLCI P，et al.Culture indepen-dent methods to assess the diversity and dynamics of microbiota during food fermentation［J］.Int J Food Microbiol，2013，167（1）：29-43.

［7］司波，徐瑾，廖永红.PCR-DGGE技术概述及其在白酒领域的应用［J］.中国酿造，2013，32（6）：16-20.

［8］DOAN T L N，KOENRAAD V H，MARGO C，et al.A description of the lactic acid bacteria microbiota associated with the production of traditional fermented vegetables in Vietnam［J］.Int J Food Microbiol，2013，163（1）：19-27.

［9］LIUWJ，BAOQH，JIRIMUTU，et al.Isolation and identification of lactic acid bacteriafromTaraginEasternInnerMongoliaof Chinaby16S rRNA sequences and DGGE analysis［J］.Microbiological Research，2012，167（2）：110-115.

［10］DEVI K R，DEKA M，JEYARAMA K.Bacterial dynamics during yearlong spontaneous fermentation for production ofngari，a dry fermented fish product of Northeast India［J］.Int J Food Microbiol，2015，199：62-71.

［11］武俊瑞，岳喜庆，石璞.PCR-DGGE分析东北自然发酵酸菜中乳酸菌多样性［J］.食品与生物技术学报，2014，33（2）：127-130.

［12］CLÁUDIA P，KARINA T M，ROSANE F S.Physicochemical and microbiological characterization of chicha，a rice-based fermented beverage produced by Umutina Brazilian Amerindians［J］.Food Microbiol，2015，46：210-217.

［13］PISACANE V，CALLEGARI M L，PUGLISI E，et al.Microbial analyses of traditional Italian salami reveal microorganisms transfer from the natural casing to the meat matrix［J］.Int J Food Microbiol，2015，207：57-65.

［14］OGUNTOYINBO F A，TOURLOMOUSIS P，GASSON M J，et al. Analysis of bacterial communities of traditional fermented West African cereal foods using culture independent methods［J］.Int J Food Microbiol，2011，145（1）：205-210.

［15］RYSSEL M，JOHANSEN P，AL-SOUD W A，et al.Microbial diversity and dynamics throughout manufacturing and ripening of surface ripened semi-hard Danish Danbo cheeses investigated by culture-independent techniques［J］.Int J Food Microbiol，2015，215：124-130.

［16］王兴春，杨致荣，王敏，等.高通量测序技术及其应用［J］.中国生物工程杂志，2012，32（1）：109-114.

［17］ERCOLINI D，DE FILIPPIS F，LA STORIA A，et al.“Remake”by high-throughput sequencing of the microbiota involved in the production of water buffalo mozzarella cheese［J］.Appl Environ Microbiol，2012，78（22）：8142-8145.

［18］ALDRETE-TAPIA A，ESCOBAR-RAM REZ M C，TAMPLIN M L，et al.High-throughput sequencing of microbial communities in Poro cheese，an artisanal Mexican cheese［J］.Food Microbiol，2014，44（6）：136-141.

［19］JUNG M J，NAM Y D，ROH S W，et al.Unexpected convergence of fungal and bacterial communities during fermentation of traditional Korean alcoholic beverages inoculated with various natural starters［J］. Food Microbiol，2012，30（1）：112-123.

［20］WANG P，MAO J，MENG X，et al.Changes in flavour characteristics and bacterial diversity during the traditional fermentation of Chinese ricewinesfromShaoxingregion［J］.Food Control，2014，44（44）：58-63.

［21］NAM Y D，LEE S Y，LIM S I.Microbial community analysis of Korean soybean pastes by next-generation sequencing［J］.Int J Food Microbiol，2012，155（1-2）：36-42.

［22］NAMY D，YI S H，LIM S.Bacterial diversity of cheonggukjang，a traditional Korean fermented food，analyzed by barcoded pyrosequencing［J］. Food Control，2012，28（1）：135-142.

［23］JI Y J，SE H L，CHE O J.Microbial community dynamics during fermentation of doenjang-meju，traditional Korean fermented soybean［J］. Int J Food Microbiol，2014，185：112-120.

［24］JUSTYNA P，ANNALISA R，VINCENZA P，et al.Bacterial diversity in typical Italian salami at different ripening stages as revealed by highthroughput sequencing of 16S rRNA amplicons［J］.Food Microbiol，2015，46：342-356.

［25］HIROSHI O，SHOKO N，JUN T，et al.Monitoring of the microbiota profile in nukadoko，a naturally fermented rice branbed for pickling vegetables［J］.J Biosci Bioeng，2014，118（5）：520-525.

［26］KIM M，CHUN J.Bacterial community structure in kimchi，a Korean fermented vegetable food，as revealed by 16S rRNA gene analysis［J］. Int J Food Microbiol，2005，103（1）：91-96.

［27］PATRICIA E，ALBA P C，ALBA Y，et al.Pyrosequencing vs.culture-dependent approaches to analyze lactic acid bacteria associated to chicha，a traditional maize-based fermented beverage from Northwestern Argentina［J］.Int J Food Microbiol，2015，198：9-18.

［28］LIU W J，SUN Z H，ZHANG Y B，et al.A survey of the bacterial composition of kurut from Tibet using a culture independent approach［J］.J Dairy Sci，2012，95（3）：1064-1072.

［29］李艳，范佳.自然发酵乳及传统开菲尔粒中酵母菌的多样性研究［J］.河北科技大学学报，2014，35（6）：561-568.

［30］陈芝兰，杨吉霞，李梦寒，等.西藏地区传统发酵乳中乳酸菌多样性及微生物数量分析［J］.食品科学，2013，34（17）：140-145.

［31］佟婷婷.四川泡菜细菌多样性分析及降生物胺菌株筛选［D］.无锡：江南大学，2015.

［32］荆雪娇，李艳琴，燕平梅，等.传统发酵蔬菜微生物群落结构分析［J］.食品与发酵科技，2016，52（1）：28-32.

［33］张先琴，张小平，敖晓琳，等.PCR-DGGE分析四川地区家庭制作泡菜中微生物多样性［J］.食品科学，2013，34（6）：137-142.

［34］LV X C，HUANG R L，CHEN F，et al.Bacterial community dynamics during the traditional brewing of Wuyi Hong Qu glutinous rice wine as determined by culture-independent［J］.Method Food Control，2013，34（2）：300-306.

［35］ZHANG X，ZHAO J，DU X.Barcoded pyrosequencing analysis of the bacterial community of Daqu for light-flavour Chinese liquor［J］.Lett Appl Microbiol，2015，58（6）：549-555.

［36］叶光斌，罗惠波，杨晓东，等.基于免培养法研究泸州地区浓香型白酒窖泥原核微生物群落结构［J］.食品科学，2013，34（17）：l76-181.

［37］潘玲玲，王媚，罗明有，等.浓香型白酒黄水、窖泥中微生物总DNA提取方法比较［J］.中国酿造，2016，35（4）：42-46.

［38］柳陈坚，刘晓峰，张海燕，等.云南省普洱市传统发酵豆豉微生物的群落多样性［J］.食品与发酵工业，2015，41（6）：47-51.

［39］李晓然，李洁，刘晓峰，等.利用高通量测序分析云南豆豉中细菌群落多样性［J］.食品与生物技术学报，2014，33（2）：137-142.

［40］董丹，关统伟，赵辉平，等.两个不同发酵时期豆瓣中微生物多样性的差异对比［J］.中国酿造，2014，33（11）：55-58.

［41］陈浩，樊游，陈源源，等.传统发酵豆制品中原核微生物多样性的研究［J］.食品工业科技，2011，32（9）：230-232.

Research progress on microbial diversity and dynamic changes of community structure in the traditional fermented food

WU Jinju，HU Jiaqi，YU Bo，LI Yunjie

（College of Chemical Engineering and Food Science，Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441053，China）

The traditional fermented food has a long history of production and consumption，which contains rich microbial resources.With the continuous development of molecular biology technology，the microbial diversity and dynamic changes of the traditional fermented food can be fully revealed at the genetic level，and the fermentation mechanism can be illuminated.It has very important significance on industrialization and standardized production of the traditional fermented food，as well as development and utilization of probiotics.

traditional fermented food；microbial diversity；community structure；dynamic change

TS205.5

0254-5071（2016）09-0020-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.005

2016-05-06

国家自然科学基金青年项目（31501456）

吴进菊（1983-），女，副教授，博士，研究方向为食品加工高新技术和食品生物技术。