外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略

孙玮遥，王向东，林　剑*

（1.烟台大学 生命科学学院，山东 烟台 264005；2.山东大学 医学院，山东 济南 250100）

外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略

孙玮遥1，王向东2，林剑1*

（1.烟台大学 生命科学学院，山东 烟台 264005；2.山东大学 医学院，山东 济南 250100）

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一，已成功表达了数百种外源蛋白。但不同外源蛋白的表达量差异较大，能够实现工业化生产的蛋白表达体系并不多，如何提高目的蛋白在该系统中的表达量有着重要的理论和现实意义。该文从发酵工艺方面对影响外源蛋白表达的各种因素做了具体阐述，主要包括培养基的选择与优化、发酵过程参数的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及诱导型毕赤酵母的甲醇流加机制，旨在提高外源蛋白表达量。

毕赤酵母表达系统；外源蛋白；发酵工艺；优化

以脱氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA）重组技术为代表的基因工程的飞速发展，为分子生物学领域的各项研究提供了契机。蛋白质作为基因表达的产物，成为了一直以来的研究热点，从而也带动了蛋白质表达系统的快速发展。毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统作为目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一，已成功表达了包括激素、疫苗、细菌毒素以及各类药用制品在内的数百种外源蛋白。

虽然已有数百种外源蛋白在毕赤酵母中表达成功，但不同外源蛋白的表达量却差异巨大。HASSLACHER M等［1］报道过的用毕赤酵母发酵生产胞内羟基腈裂解酶，表达量可达22 g/L，而WEISS S等［2］用毕赤酵母表达仓鼠阮病毒蛋白质PrPc的表达量却不足0.1 mg/L。因此，研究不同蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达机制及发酵条件具有重要意义。

影响不同外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素一方面来自于细胞水平的工程菌构建，即通过基因操作手段提高单个细胞的蛋白分泌量；另一方面，从宏观角度上通过优化发酵工艺来提高外源蛋白的表达量。由于现阶段毕赤酵母表达系统的分子生物学研究已比较透彻，因此，本文主要从发酵工艺方面探讨了影响外源蛋白表达量的条件，主要包括培养基的选择与优化、发酵过程参数的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及诱导型毕赤酵母的甲醇流加机制，以提高外源蛋白的表达量，为实现工业化生产提供指导。

1　培养基的选择与优化

1.1基础培养基的选择

基础培养基为毕赤酵母生长提供必须的氮源、碳源、生物素等营养物质，对菌体的生长和外源蛋白的表达有直接影响。现在毕赤酵母发酵大都采用Invitrogen公司提供的缓冲甘油培养基（buffered glycerol-complex medium，BMGY）/缓冲甲醇培养基（bufferedmethanol-complexmedium，BMMY）和最小缓冲甘油培养基（bufferedminimalglycerol，BMG）/最小缓冲甲醇培养基（buffered minimal methanol，BMM），这两种培养基中含有磷酸盐缓冲液，能使pH稳定在一定范围内，因此适合于表达pH不能在线控制情况下的分泌型外源蛋白。发酵罐规模的培养基大多采用成本较低的基础盐培养基（basal salt medium，BSM）和FM22等培养基，这类培养基通常以菌体利用较快的甘油为碳源，添加各种无机盐离子以及微量元素、生物素等组成的营养盐，发酵过程中以流加氨水的方式调节pH同时补充氮源。但营养盐和生物素需要单独过滤除菌，增加了发酵操作的复杂性，且培养基中由于盐离子浓度过高往往在灭菌后形成沉淀，影响菌体的正常生长。COS O等［3］对BSM和FM22培养基与D'ANJOU M C等［4］设计的基础盐培养基的组分差异做了分析，指出氮源添加方式的不同会对菌体生长以及蛋白表达产生影响。以流加氨水控制pH的方式补充氮源，易形成氮源缺乏造成蛋白酶分泌量增加，从而造成外源蛋白的减产。所以，BSM和FM22这类培养基在使用过程中需要补充一定量的氮源，如（NH4）2SO4等无机氮源。但是，氮源浓度过高也会引起菌体生长的滞后。陈明祥等［5］研究了培养基中（NH4）2SO4浓度对南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarcticalipase，CALB）表达量的影响，结果表明，（NH4）2SO4质量浓度高于10 g/L时，NH4+浓度高于100mmol/L，细胞浓度及表面展示CALB酶活力下降近30%。因此，通常控制培养基中NH4+浓度不超过100mmol/L。

碳源是菌体生长不可或缺的结构性底物。研究发现，菌体对甘油的利用效率高于葡萄糖等碳源物质，更有利于促进细胞增殖与产物积累［6］。所以，现在多采用甘油作为发酵核心碳源。但甘油浓度过高或过低时都会影响菌体生长，且甘油对启动子AOX有抑制作用，因此发酵过程需要严格控制甘油浓度。另外，甘油的成本较高，较大规模的工厂化发酵还需考虑成本问题，因此，工业上发酵生产附加值低的植酸酶等产品时，通常选用较廉价的葡萄糖作为碳源［7］。另外，有研究者尝试将麦芽汁、麦麸类作为毕赤酵母培养基用以表达外源蛋白，提高了产出与投入比，降低了发酵成本［8］。

1.2补料流加方式的优化

菌体生物量的积累是提高外源蛋白表达量的关键。当生长阶段培养基中碳源耗尽时可以通过流加补料方式补充甘油，使菌体再次生长到达更高生物量水平。这个阶段的补料碳源、补料速率、流加方式及时间等都是细胞增殖效率的影响因素。为了实现毕赤酵母高密度培养的工业化放大，不少研究者对补料方式做了深入研究［9］。常用补料方式包括3种：间歇性流加补料、恒速流加补料以及指数流加补料。间歇性流加和恒速流加方式较为普遍，且操作简单，但往往不能很好的满足菌体生长需要。指数流加是根据菌体生长规律而建立的补料方式，这种方式能较好的保持补料速率与菌体需求的一致性，但对菌体生长速率的把握有一定难度。研究发现，当以较高的速率补充甘油能达到高细胞密度，但同时易积累过量的乙醇及乙酸盐从而造成活性蛋白的减产；当以较低的速率补充甘油时有利于产物表达量的提高，但却延长了过渡期，不利于工业化生产。因此，发酵过程中应合理把握细胞每个阶段的比生长速率，以此调整甘油的流加速率，提高底物利用率，为工业化生产提供指导。

2　发酵过程参数控制

2.1温度

温度对毕赤酵母发酵过程中菌体的生长以及外源蛋白的表达都有重要影响。温度通过影响参与微生物体内反应的各种酶活性，进而影响菌体的生长速率和产物合成速率。因此，选择合适的发酵温度极其重要。毕赤酵母的最适生长温度是30℃，而诱导表达的温度则因外源蛋白的不同存在差异，但一般都≤32℃，因为较高温度下外源蛋白表达量显著下降，细胞衰亡速率增加。不少研究者指出，低温更有利于诱导外源蛋白的合成［10］。ZHOU X等［11］研究了不同诱导温度对人源类溶菌酶LYZL6表达量的影响，发现将温度从30℃降低至24℃能大幅度提高蛋白表达量。JIN H等［12］采用低温方式发酵外源α-干扰素，结果表明，20℃时的表达量是30℃时表达产量的1.6倍，可达到5 g/L。不同外源蛋白表达体系的最适诱导温度往往不同，因此，针对不同外源蛋白，选择最适的诱导温度能有效提高目的蛋白的表达量。

2.2pH

pH作为发酵过程中重要的化学参数，对发酵液的物理性质、细胞膜的电荷状态及参与细胞反应的酶活性等有重要影响，进而影响菌体的生长及目的蛋白质的表达。据研究报道，pH在3.0～7.0的范围内毕赤酵母均可以正常生长，低于2.2时细胞生长会受到抑制［13］。但考虑到菌体细胞膜的性质，以及毕赤酵母生长过程中产生的各种代谢产物会对后期诱导表达产生重要影响，因此，通常选择控制发酵pH在4.0～6.0范围内。目前，在毕赤酵母工程菌发酵生产过程中，一般采用通过流加氨水变调pH的方法来控制菌体的生长和目的产物的表达。大规模发酵使用BSM培养基时，细胞生长期的pH一般为5.0，因为超过该值时，培养基中无机盐离子易形成沉淀，对发酵产生不利影响。在分泌型蛋白表达过程中，选择合适的诱导pH能通过改善菌体内某些酶的活性，促进对营养物质的吸收及代谢，从而提高目的蛋白的表达量［14］。

2.3溶氧

毕赤酵母是一种强好氧微生物，在进行发酵培养时，菌体的快速增长伴随着耗氧量的增大，且菌体的生长期和产物表达期对氧的需求量往往不一致［15］。如果供氧不足，容易造成菌体生长受限，进而影响目的蛋白的表达。因此菌体生长期时，溶氧（dissolved oxygen，DO）一般控制在30%以上，而在诱导表达阶段维持在20%以上［16］。另外，当流加补料过程中甘油浓度过高，而溶氧供应不足时，发酵液中往往会积累甘油厌氧发酵生成的乙醇、乳酸等副产物，会对发酵产生不利影响。因此，控制发酵过程中的溶氧水平对于高效表达外源蛋白至关重要。然而，溶氧水平过高也会对菌体生长和繁殖产生影响［17］。有研究发现，发酵液中高浓度的氧自由基会对细胞产生毒害作用［18］。因此，针对不同的反应体系，需要控制溶氧浓度在适宜的范围内，才能保证外源蛋白的高效表达。

3　分泌型蛋白酶的降解抑制

对于分泌型外源蛋白来说，蛋白酶的降解作用常常是造成发酵液中外源蛋白浓度低下的重要原因。蛋白酶降解不仅能引起发酵液中外源蛋白浓度的下降，还会造成生物活性的降低，同时也会增加产品分离纯化的难度。发酵液中外源蛋白的降解主要是被培养基中胞外蛋白酶、细胞外膜结合蛋白酶和细胞自噬释放的胞内蛋白酶降解的。因此，降低毕赤酵母自身蛋白酶的分泌、抑制其酶活性是提高发酵液中外源蛋白浓度的重要方法。有研究表明，各种胞外蛋白酶的量会随着发酵条件的改变而变化，如发酵过程中的饥饿胁迫、碳源改变、温度和pH变化及有毒有害产物的形成等。所以，通过优化发酵条件，能有效控制蛋白酶分泌量。目前主要采用的方式有：（1）在保证目的蛋白稳定性的前提下，通过调节发酵液的pH、降低诱导温度来抑制蛋白酶活性［19］。（2）在培养基中添加适量的蛋白酶底物如蛋白胨、酪蛋白等，以降低对目的蛋白的降解作用。（3）在培养基中添加乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）等酶抑制剂，抑制蛋白酶活性，从而减少目的蛋白的降解。本实验室在研究重组人血清白蛋白表达的过程中发现，向发酵液中添加硫酸铵能抑制蛋白酶的活性，当保持发酵液中铵离子质量浓度为3.0 g/L时，能有效缓解发酵液中白蛋白的降解速度，提高发酵液中白蛋白产量［20］。（4）将外源蛋白与另一种能够在毕赤酵母中稳定的蛋白伴侣融合表达，也能减少目的蛋白的降解［21］。

4　甲醇流加机制的建立

诱导型毕赤酵母表达外源蛋白的第一步即在培养基中添加甲醇，一方面添加的甲醇为菌体生长提供碳源；另一方面，甲醇在启动子AOX基因编码的醇氧化酶的催化下分解，调控表达目的蛋白。因此，在诱导期，调控甲醇诱导机制对提高外源蛋白表达量有重要影响。当甲醇浓度太低时，由于诱导剂的缺乏，蛋白表达量极低，且易被自身蛋白酶降解。而当甲醇浓度过高时，过量的甲醇对细胞有毒害作用，从而降低产物表达量。合理控制发酵液中甲醇浓度成为高密度发酵的关键问题。

4.1甲醇浓度的检测方法

目前来看，甲醇浓度的检测方法主要分为离线检测和在线检测两种。常用的离线检测方法主要是气相色谱法、高效液相色谱法、酶化学法、分光光度计法以及近红外光谱法。但这种离线检测的滞后性容易造成发酵液中某一时刻甲醇浓度的突变，对目的产物的表达造成不利影响。因此，人们逐渐发展了甲醇的在线检测技术。SURRIBAS A等［22］提出了顺序注射分析法（sequentical injection analysis，SIA）在线监测甲醇浓度。这种方式基于生物传感器技术，每小时可连续检测7个样品，检测偏差小，具有较好的应用性。之后，国内外又相继报道了固定化酶—化学发光检测法［23］、YSI-2700甲醇选择分析仪［24］以及蒸汽传感器［25］等方法在线监测甲醇浓度。近年来，华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室对甲醇等底物的在线检测做了深入的研究。吴胜等［26］通过使用衰减全反射技术结合傅里叶红外光谱法，建立了甲醇浓度的预测模型，成功在5 L发酵罐中监测甲醇的浓度变化，为提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达量提供了指导。

4.2甲醇流加策略

除了直接以检测含量的方式控制发酵液中甲醇浓度外，还可以通过合适的策略优化甲醇的流加方式。现在毕赤酵母发酵研究中最常用的两种方式分别是根据溶氧控制甲醇流加和维持菌体比生长速率恒定的甲醇流加方式。

4.2.1根据溶氧变化流加甲醇

微生物发酵过程中，溶氧等参数可以反映碳源的消耗情况。当碳源耗尽时，微生物的生长代谢就会停止，DO值会上升；这时如果向反应器中重新补充碳源，微生物的生长代谢就会重新开始，氧的消耗就会增加，则发酵液中的溶氧浓度DO值就要随着下降。因此，当甲醇作为诱导期唯一碳源时，可以根据溶氧变化调节流加速率。已有许多研究者报道了用这种方式控制甲醇的流加并取得了较高的目的蛋白表达量［27］。但这种方式存在一定的问题。当甲醇浓度过高时，菌体生长受到抑制，同样会表现为DO值的上升。这时如果再加入甲醇，就会造成甲醇积累，对菌体生长和蛋白表达造成严重影响。而且在应用这种调节方式的过程中，甲醇的流加是采用脉冲式的，其浓度在不断变化，而菌体的比生长速率也在不断地变化，因此，对研究这些变量对外源蛋白表达量的影响，建立以溶氧浓度DO值为依据的甲醇流加机制也有一定的困难［28］。

4.2.2维持恒定比生长速率的流加方式

维持恒定的比生长速率有利于获得高生物量，将此方法应用在毕赤酵母发酵过程中，以开放型流加方式控制甲醇的流加对于提高目的蛋白表达量起到了重要作用［29］。这种方式建立在简单的细胞生长模型之上，不需要任何反应器参数指导，甲醇的流加速率取决于基于质量平衡方程理论上的恒定比生长速率。D'ANJOU M C等［30］研究了按照菌体的生长规律，在合理的模型指导下，以相应指数形式流加甲醇和甘油的混合底物可获得较高的目的产物表达量。TRINH L B等［31］同时比较了甲醇传感器在线监测法、溶氧参数法和恒定比生长速率的模型流加方式三种方式在表达内皮抑制素过程中的差异。结果表明，三种流加方式的最终蛋白表达量均为133 mg/L，但是控制比生长速率为0.02 h-1的模型流加方式由于限制了甲醇的流加量，生物量明显低于其他两种方式，从而使得相同甲醇耗用量下，单位细胞浓度的蛋白产量比其他两种方式提高了2倍。因此，这种模型流加方式不仅有效地提高了蛋白表达量，还降低了甲醇消耗量，节约了生产成本。针对不同的蛋白表达体系，具体的甲醇流加方式还有待进一步的实验摸索确认，以寻求适合蛋白分泌表达的最优条件。

5　总结与展望

毕赤酵母表达系统自20世纪80年代发展至今，在外源蛋白表达方面显现出了独特优势，因而受到越来越多的关注。但由于外源蛋白的特异性，不同蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达量差异显著，极大地限制了工业化生产。由于现阶段毕赤酵母表达系统的分子生物学研究已比较透彻，因此，在表达系统构建成功的基础上，进一步优化发酵培养条件是提高外源蛋白表达量的有效手段。在发酵过程中，发酵条件的选择、工艺参数的确定以及诱导机制的建立都与外源蛋白的表达量有着密切关系。众多的研究结果表明，不同外源蛋白因分子量等性质的不同、结构的差异等，其发酵工艺参数与蛋白表达量的关系也不同，因此，根据表达蛋白自身性质的不同而建立相应发酵工艺体系对于深入研究外源蛋白性质与表达机制的关系有重要意义，也为探索新型外源蛋白在毕赤酵母中的表达提供指导。

目前，很多实验室规模的外源蛋白的过程控制和优化技术已经取得了较好的成果，但放大到工业化规模生产上却受到种种限制。因此，深入研究发酵控制策略在中试生产中的应用将是未来毕赤酵母工艺优化的重要发展方向。相信随着研究的不断深入，毕赤酵母表达系统在分子生物学、微生物学、发酵工程及生物制药等领域的应用将越来越广泛。

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High efficiency expression strategy for heterologous protein inPichia pastoris

SUN Weiyao1，WANG Xiangdong2，LIN Jian1*
（1.College of Life Science，Yantai University，Yantai 264005，China；2.School of Medicine，Shandong University，Jinan 250100，China）

ThePichia pastorisexpression system is one of the most widely used protein expression systems.Several hundreds heterologous proteins were expressed successfully.It was successfully expressed several hundred kinds of heterologous protein，but few protein expression system can realize industrialized production.How to improve the expression quantity of target protein in the system has important theoretical and practical significance.Various factors influencing the expression of heterologous proteins in fermentation process were discussed specifically from the aspects of fermentation process，including the selection and optimization of culture medium，control of fermentation parameters，degradation inhibition of secreted protease and mechanism of methanol flow in inducibleP.pastoris，in order to improve the expression quantity of heterologous protein.

Pichia pastorisexpression system；heterologous protein；fermentation process；optimization

Q815

0254-5071（2016）09-0011-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.003

2016-06-07

国家自然科学基金（81370881）；烟台大学研究生科技创新基金重点项目（YDZD1610）

孙玮遥（1992-），女，硕士研究生，研究方向为微生物发酵。

林剑（1963-），男，副教授，本科，研究方向为微生物发酵。