废弃毕赤酵母核糖核酸提取条件的优化

卜光明， 颜 茜， 杨海龙*

（1.浙江瑞邦药业股份有限公司，浙江 温州 325000；2.温州大学生命与环境科学学院，浙江 温州 325035）

核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）是生物体内的高分子化合物，对维持机体的正常功能有重要作用，是特定生理条件下不可缺少的营养成分。外源性核糖核酸在机体营养、免疫调节和疾病防治等方面都有一定的功能，核酸类物质可以作为营养保健食品的添加剂，对促进儿童的生长发育、减缓老年人的衰老和病后虚弱身体的康复均有一定效果；在农牧渔业中，核酸类物质可以用作植物生长刺激剂和饲料添加剂[1-2]。

酵母中RNA含量高，适合于工业化生产，如利用酿酒酵母、产朊假丝酵母等微生物发酵制备[3-4]；同时，采用啤酒酿造产生的废弃酵母等原料提取也是获得RNA的重要途径[5-6]。甲醇营养型毕赤酵母（Pichia pastoris）是能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌，作为一类优秀的表达系统，除了具有蛋白质的加工和折叠等真核表达系统所共有的优点外，还兼具诸如大肠杆菌等微生物的易于操作的特点；与动物细胞等真核表达系统相比，它具有简便、快捷、成本低、表达水平较高等优点。毕赤酵母表达系统已被广泛应用于植酸酶、木聚糖酶、白蛋白等产品生产基因工程菌的构建[7-10]，并实现了这些产品的工业化生产。在生产过程中会产生大量的毕赤酵母菌体，如不加以处理不仅会造成资源浪费，还会导致严重的环境污染[11]。为实现废弃资源的综合利用，本文研究了从废弃毕赤酵母提取核糖核酸的工艺条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

废弃毕赤酵母：为植酸酶毕赤酵母基因工程菌发酵副产物，由北京中农博特生物工程技术有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 毕赤酵母核糖核酸的提取

提取工艺：取废毕赤酵母泥→按其干重配成一定浓度的悬浮液100 mL→加入一定浓度的氢氧化钠调节其pH值→在一定温度下保温提取一定时间→离心→弃去残渣→上清液调节pH至等电点→过夜沉淀→离心取沉淀→核糖核酸→干燥后称重。

1.2.2 毕赤酵母核糖核酸含量的测定[6]

采用紫外分光光度法测定，取一定量的RNA样品，用水定容至100 mL，经适当稀释后分别测定吸光值A260和A280，并计算A260/A280判断所提取核糖核酸样品的纯度。由以下公式计算核糖核酸的提取率：

式中：A260为样品波长260 nm处的吸光度值；100为样品定容的体积；N为稀释倍数；m为称取的 RNA样品重量 （g）；106为 μg转换为 g；0.024 为 1 μg/mL RNA 的 A260。

1.2.3 毕赤酵母核糖核酸提取条件优化的试验设计

影响毕赤酵母核糖核酸提取的因素有很多，本文利用正交试验设计研究溶液pH值、提取温度、提取时间、毕赤酵母浓度对核糖核酸提取的影响。根据单因素试验结果，设计四因素三个水平正交试验，如表1。

表1 L9（34）正交实验因素水平表Table 1 Factors table of orthogonal test

2 结果与讨论

2.1 pH值对核糖核酸提取的影响

配置10%浓度的毕赤酵母溶液100 mL，分别调 pH 至 7、8、9、10、11， 于 85 ℃下抽提 1.5 h，离心取上清液，调至核酸等电点（pH=2.5），过夜沉淀得到RNA，结果见图1。由图1可知，核糖核酸的提取率随pH值的增大而增大，pH为9时提取率达到1.74%。而在啤酒酵母的提取中，pH=7.5时，核糖核酸的提取率和纯度达到最大[12]，且随着pH值的增大，提取率逐渐减少。啤酒酵母和毕赤酵母的细胞壁结构成分上存在一定的差异，pH较大的情况下对毕赤酵母细胞壁的作用更好，使其具有较好的通透性。因此，可以选择pH=9进行下面的试验。

图1 pH值对RNA提取率的影响Fig.1 The effects of pH on the extraction of RNA

2.2 提取温度对碱法核酸提取的影响

配置10%浓度的毕赤酵母溶液100 mL，调pH至9，分别置于55℃、65℃、75℃、85℃、95℃下抽提1.5 h，离心取上清液，调至核酸等电点，过夜沉淀获得RNA，结果见图2。由图2可知，温度越高，促进了碱对毕赤酵母细胞壁的作用，使核糖核酸释放得越多，核糖核酸的提取量随温度的升高而增大，温度95℃时提取量达到1.85%。

图2 提取温度对RNA提取率的影响Fig.2 The effects of temperature on the extraction of RNA

2.3 提取时间对碱法核酸提取的影响

配置10%浓度的毕赤酵母溶液100 mL，调pH 至9置于 95℃下，分别提取 0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，离心取上清液，调至核酸等电点，过夜沉淀获得RNA，结果见图3。由图3可知，在0.5～2.5 h内，核糖核酸的提取量随时间的加长而增大，2.5 h后核糖核酸提取量不再增加，而且随着时间的加长，核糖核酸在碱性条件下会有一部分水解成核苷酸而导致提取率降低[13]，故核糖核酸提取的最佳抽提时间为2.5 h，核糖核酸提取率达到1.92%。

图3 提取时间对RNA提取率的影响Fig.3 The effects of reaction time on the extraction of RNA

2.4 酵母浓度对碱法核酸提取的影响

分别配置浓度为3%、6%、9%、12%、15%的毕赤酵母溶液各100 mL，调pH至 9，于95℃下抽提1.5 h，离心取上清液，调至核糖核酸等电点，过夜沉淀获得RNA，结果见图4。由图4可知，毕赤酵母浓度为6%时，核糖核酸的提取率最大（2.89%），进一步提高毕赤酵母的浓度，固液比增大，在特定时间内碱性溶液与毕赤酵母作用强度有限，影响了核糖核酸的释放，导致提取率的降低。

2.5 提取工艺的优化

根据表1的正交试验设计进行正交试验，得到正交试验的结果见表2。由极差分析可知，对碱法提取毕赤酵母核糖核酸含量的影响因素依次为：抽提温度＞溶液pH＞酵母浓度＞抽提时间。抽提时间的影响作用最小，但如果抽提时间过长，杂质会相应地增多。根据以上分析结果，确定在本实验所选因素条件下，以酵母浓度3%，pH=10，抽提温度为100℃，抽提时间为2.5 h时，核糖核酸提取率最高。

图4 酵母浓度对RNA提取率的影响Fig.4 The effects of P.pastorisconcentration on the extraction of RNA

表2 正交试验方案设计及结果（L9（34））Table 2 Orthogonal experimental design and results

2.6 优化条件的验证

以正交实验分析法选出的最适宜提取毕赤酵母核糖核酸的条件进行5组实验，得到的核糖核酸提取率分别为 3.05%、2.98%、3.24%、3.13%、3.16%，平均提取率为3.11%

3 小结

本文研究了碱法提取毕赤酵母核糖核酸的工艺条件，单因素试验结果表明毕赤酵母核糖核酸提取的条件为：pH=9、时间 为2.5 h、温度为95℃、酵母浓度为6%。经正交试验优化确定毕赤酵母核糖核酸提取的最佳工艺条件为：pH=10，提提温度为100℃，时间为2.5 h，酵母浓度为3%，最佳工艺条件下，核糖核酸的提取率可达3.11%。目前，以毕赤酵母为表达系统开发的基因工程均采用高密度发酵进行生产，产生大量的酵母菌体，从废弃毕赤酵母泥中提取核糖核酸，是实现废弃毕赤酵母综合利用的有效途径。