线粒体DNA及相关基因与衰老的关系

莫　菲　管德龙　韩　燕　张　敏

(陕西师范大学生命科学学院，陕西　西安　710119)

线粒体DNA及相关基因与衰老的关系

莫菲管德龙韩燕张敏

(陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710119)

〔关键词〕线粒体DNA；多态性；衰老

线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本功能细胞器，是细胞进行氧化磷酸化的场所。线粒体DNA(mtDNA)属于真核细胞核外遗传物质，结构简单，位于线粒体基质中，有时与线粒体内膜结合存在。大多数多细胞生物的mtDNA都是以共价、闭合的环状分子形式存在。不同物种的mtDNA大小悬殊，一般植物mtDNA较大，其分子大小范围为186～2 400 kb；动物mtDNA较小，约为15.7～19.5 kb，其中人及大多数动物细胞的mtDNA约为16.5 kb〔1〕，昆虫mtDNA大小一般为15.4～16.3 kb，并且以较高拷贝数存在于线粒体内〔2〕。mtDNA进化速率较核DNA(nDNA)快，遗传过程不发生基因重组、倒位、易位等突变，且严格遵守母系遗传方式，是相对独立的遗传系统〔3〕。mtDNA不仅是研究DNA结构与复制转录的良好模型，也是研究核酸与蛋白质结合非常合适的模型系统〔4〕。Anderson〔5〕用氯化铯密度梯度离心法首次分离得到mtDNA并进行全序列分析，此后mtDNA的研究日益得到研究者的重视，其中，有关mtDNA多态性的研究由于与机体衰老和种间亲缘性等密切关系而成为研究热点。

衰老是生物随着时间的推移，自发的必然过程，它是复杂的自然现象，表现为结构和技能衰退，适应性和抵抗力的减弱〔6〕。衰老是多因素导致的，其中包括自由基致使细胞损伤导致的衰老、程序性细胞凋亡引起的衰老和mtDNA突变引发的衰老等。Kovalenko等〔7〕提出mtDNA突变在组织细胞衰老过程中起着重要作用，发现衰老的根本原因是由于mtDNA突变引起细胞凋亡，而不是自由基增多引起的细胞损伤所导致的。mtDNA突变主要有三种：①缺失突变：主要发生在D环区，往往造成线粒体功能下降；②点突变：主要发生在编码蛋白质和转运RNA(tRNA)区；③串联重复：是指碱基序列的重复，其中mtDNA点突变和缺失突变发生频率较高。但mtDNA突变的生物学意义目前不是十分清楚，推测可能是重复突变后，表达过多种类的蛋白质从而造成线粒体呼吸链组装障碍而导致衰老甚至相关疾病发生〔8〕。最近有研究指出，mtDNA突变能开启一种信号级联放大过程，从而导致细胞程序性死亡，这一发现有助于揭示母系遗传学的分子途径〔9〕。本文通过对依赖性丝氨酸蛋白基因(LONP)1、DNA2和热激蛋白(DNAJ)A3三个基因在线粒体中的信号通路及生化反应，从正向和负向两个方面对机体衰老在分子方面进行全面阐述。

1mtDNA

mtDNA是细胞内较小而又易于纯化的复制转录单位，基因组结构比较简单，且具有很高的专一性。通过对mtDNA测序研究发现，绝大多数动物mtDNA的组成是相同，哺乳动物mtDNA的大小为16 kb左右，分为编码区和非编码区。其中编码区包含2个核糖体RNA基因(rDNA)，22个tDNA基因和13个编码蛋白质的基因。

1.1mtDNA结构组成

1.1.1编码区线粒体rRNA基因的结构比核rRNA基因简单得多，其分子结构域进化的平均速率受其功能制约。绝大多数的线粒体或核rRNA基因都存在一个规律性的三叶草形二级结构〔10〕，线粒体rRNA基因相对于蛋白质编码基因而言，其进化速率要慢得多。除tRNA基因外，线粒体基因组基因序列非常保守，但在rRNA基因、tRNA基因及编码蛋白质基因之间，由于其结构和功能上的不同，进化方式也存在较大差异〔11〕。

蛋白质编码基因和RNA基因的主要差别是前者含有一个编码氨基酸的开放阅读框，由于蛋白质编码密码子的简并性，这些蛋白质基因受到限制较少。13个蛋白质编码基因分别为1个细胞色素b基因(Cytb)，2个三磷酸腺苷(ATP)酶亚基基因(ATPase6、ATPase8)，3个细胞色素C氧化酶亚基基因(COX1、COX2、COX3)，7个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化还原酶亚基基因(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6)〔12〕。在不同物种的种属间相应的线粒体蛋白质编码序列的比较显示，CoⅢ、CoⅡ、CoⅠ和Cytb基因较保守且同源性较高，ATPase8、ATPase6和ND基因变异性较大。

1.1.2非编码区非编码区分为轻链复制起始区和控制区两部分，mtDNA碱基对中有少数碱基对构成复制起始区的特有序列，这个序列有一个突出的D-loop(d placement-loop region)结构。D-loop为mtDNA的分子控制区，该区为A+T碱基富集，能被一些特异分子识别。同时D-loop也是整个线粒体基因组序列和长度变异最大的区域，其进化速度最快，基因排列紧凑，几乎没有间隔序列和内含子，便于进行种内种间的系统进化分析。非编码区主要是在A+T富集区，mtDNA复制原点就在其中，可控制复制的起始和转录，因此也称为控制区，其变异程度最大，可用于分析亲缘关系较近的分类单元。研究〔13〕证明线粒体D-loop区具有较高多态性及与突变有关的敏感区域，其中相关基因的突变可导致多种肿瘤和疾病的发生。而在线粒体A+T富集区发生的核苷酸替换、转换和颠换，被认为是由A+T富集区中片段的保守程度不同所造成的，且发现茎-环结构含一链合成的起点位置〔13〕。另外，在家蚕〔14〕、印第安白蚁〔15〕等其他较低等的物种中也有相类似的研究结果。

1.2mtDNA多态性研究方法mtDNA多态性可对生物体寿命进行一定影响，它是mtDNA在不同种群间或种群内表现出的变异现象，是由碱基的增加、缺失或置换造成。近些年，mtDNA多态性研究逐渐被人们所重视，研究发现mtDNA的多态性不仅是物种进化的关键〔16〕，而且也与物种寿命有极为密切的关系。目前普遍采用研究mtDNA多态性的方法有限制性片段多态性分析(RFLP)和测序法。

1.2.1测序法测序法是直接测定mtDNA的全序列或者片段序列，比较不同物种或个体间的相关序列，研究其起源。何芳等〔17〕采用聚合酶链式反应(PCR)方法对2条代表性成虫线粒体基因组进行测序及序列拼接，得出线虫线粒体基因组存在重复序列且两条基因组大小存在很大差异，排列顺序也各不相同。作为线粒体基因组遗传多态性的研究方法，测序法虽能获得大量可靠数据，但技术条件要求高、费用大，并不适合大群体遗传进化的研究〔18〕。

1.2.2RFLPRFLP是利用限制性内切酶识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性。RFLP技术具有快速、经济，精确度较高等特点，适用于大群体、大样本种群寿命研究。在mtDNA多态性对寿命影响这一研究领域中，最为热门的应当是人类寿命研究，通过对新疆百岁老人聚居地人口mtDNA研究显示，百岁组和长寿组5178A等位基因和10398G等位基因频率较为对照组明显增加〔19〕，这就证明mtDNA多态性与寿命密切相关。mtDNA的进化也是多态性的一种表现形式，mtDNA进化的主要方式表现为DNA分子结构的改变，包括转换和颠换两种方式。大量研究〔20〕表明，mtDNA较快的进化速率主要由转换造成，在种内比较中，转换在数量上通常超过颠换10～20倍。在mtDNA所有基因和密码子中发现，转换数明显超过颠换数，这种偏倚可能是决定mtDNA的进化速率的重要因素。同时，这种转换偏倚似乎与序列间的差异存在一定相关性，即转换偏倚的比率与物种从共同祖先进化的时间呈反比。碱基替换主要发生在基因控制区和间隔区，且不同区域基因的进化速度存在明显差异〔21〕。mtDNA核苷酸序列的差异程度能反映物种内或种间亲缘关系的远近，常用于不同群体水平的遗传分析。其中D-loop区是整个mtDNA基因组中碱基突变和长度变异最大的区域，其碱基替换率比mtDNA的其他区域高5～10倍〔22〕。

2mtDNA突变与衰老的关系

与衰老相关的理论有自由基学说、程序性衰老理论、体细胞突变学说及mtDNA突变引起的衰老。衰老主要包括功能损失和老化细胞衰老，功能损失是指对疾病的抵抗能力、平衡能力、生殖能力降低及机体的损伤老化等；而老化细胞衰老的定义更加广泛，包括机体早衰和发育至成熟期。线粒体相关基因从不同方面对机体衰老进行的调控，进而影响机体在不同生长发育时段的各项技能。mtDNA和衰老相关基因多与mtDNA复制、修复和凋亡调控有关。

2.1LONP1基因LONP1基因表达翻译的蛋白为ATP-依赖性丝氨酸蛋白酶，蛋白序列长度为959AA，属于肽酶S16家族，存在于线粒体基质中。ATP-依赖性丝氨酸蛋白酶介导错误折叠的选择性降解、未装配或氧化性损伤的多肽及某些短期调控蛋白。同时LONP1基因还具有类似分子伴侣功能介导内膜蛋白复合物的装配，并参与线粒体基因表达的调节和线粒体基因组的完整性维护。该基因可与线粒体基因组启动子和RNA单链中的特异性位点结合，此后与单链DNA对应的特异性结合位点配对，靶向调节蛋白结合位点和mtDNA启动子及其相邻位置的衰老退化，并对mtDNA的复制和相关基因表达进行调控。在维护线粒体基因组结构完整性方面，其作用功能包括mtDNA自身及其姐妹染色单体的复制。在细胞水平，参与细胞合成和调控过程，其中包括对线粒体形态、分布、线粒体基因组的复制及新合成的mtDNA组装等调控机制〔23〕。

2.2DNA2基因DNA2基因与LONP1基因在某些方面类似，也参与mtDNA与nDNA的复制过程。DNA2通过招募RecQ dna解螺旋BLM蛋白，介导5′-单链DNA的裂解，而3′-单链DNA断裂可阻止复制蛋白(RP)A的形成，从而对DNA的复制过程造成影响。

此外，DNA2还参与DNA复制检验点对独立冈崎片段的处理过程，且具有ATP酶和核酸内切酶的酶活性。DNA2具有5′-3′解旋酶活性，但因解旋酶活性较弱，在功能方面的研究仍不清楚。DNA的复制和修复是所有细胞的核心流程，这一过程需要核酸酶及解旋酶的参与以处理不同的DNA中间结构，从而维持基因组稳定性。而DNA2就属于解旋酶/核酸酶家族，在DNA复制和修复过程中起功能调节作用。在酵母菌中，DNA2在nDNA复制过程中参与RNA引物的剔除，同时在紫外线伤害修复、基础伤害修复及双链沉默中都起到重要作用。数据表明，人类DNA2不定位于细胞核，因为它与酵母DNA2基因相比，缺少一个核定位序列(NLS)。人类DNA2迁移到线粒体时，与mtDNA聚合酶相互作用，这一相互作用对聚合酶活性的刺激十分显著〔24〕。在线粒体DNA复制和“长补丁”碱基切除修复(LP-BER)中，DNA2可与皮瓣内切酶1发生协同作用。参与所有的重组过程，有助于维护适当的端粒长度。正常细胞随着复制能力下降，其端粒长度会逐渐变短，端粒长度受到染色体端粒酶活力的调节，端粒酶以端粒RNA为模板合唱端粒序列而使端粒延长。端粒酶活性的高低直接影响端粒长度的增减，而端粒的长短直接影响细胞内基因的表达，进而影响到细胞的增殖和寿命。机体内的各类生化反应及各种反应通路都有可能导致DNA内部3′端脱氧核糖核苷酸链中的个别5′-磷酸二酯键遭到水解，造成DNA损伤〔25〕。

2.3DNAJA3基因DNAJA3基因参与调节线粒体基质内凋亡信号转导及效应器结构，从而影响线粒体和半胱氨酸蛋白酶(caspase)3的活化，细胞色素C的释放，但该基因不能活化蛋白酶8的活性。同种DNAJA1可增加凋亡的肿瘤坏死因子，即与DNA损伤剂四链霉素C结合，促进肿瘤细胞的凋亡。2型可抑制细胞凋亡，调节干扰素(IFN)-γ介导的转录活性；亚型2可能作为麝香信号通路的效应器而存在，作用于神经肌肉接头处。DNAJA3所调控参与的细胞凋亡过程，可激活细胞周期阻滞，当细胞色素C从线粒体中被释放，形成凋亡酶激活因子(APAF1)复合体，激活半胱氨酸内肽酶活性，进而促使细胞凋亡的发生。有研究〔26〕发现，DNAJA3可促使细胞通过细胞周期阻滞停止生长，进而出现细胞老化或凋亡的现象。除上述正向调节细胞凋亡的过程以外，DNAJA3还具备负向调控的功能〔26〕。该基因通过阻止或减少参与细胞凋亡过程中的半胱氨酸型内肽酶的活性，从而降低凋亡速率和程度或抑制、减缓细胞凋亡的进程。

3mtDNA突变与人类疾病的相关研究

mtDNA突变会导致某些蛋白功能的改变，从而影响生物的适应能力，利用生物信息学手段从分子角度研究mtDNA的突变将为后续一些与线粒体相关的疾病研究提供基础材料〔27〕。人类mtDNA总长度为16 500碱基对，常见的DNA片段丢失为5 000碱基对、7 400碱基对及3 800碱基对〔28〕。动物实验也证明了mtDNA随着年龄的增长而逐渐丢失〔29〕。DNA的内源性氧化损伤可产生大量的8氧-7,8-二氢脱氧鸟苷(O8dG)，O8dG是mtDNA脱氧尿苷与氧自由基的加成产物，可作为mtDNA氧化损伤的鉴定指标，实验证实，线粒体的异常突变可引起呼吸功能的衰退，心脑血管细胞的损伤；医学方面研究发现老年性糖尿病、冠状动脉粥样硬化及阿尔茨海默病等相关疾病均与mtDNA片段丢失有关〔30〕。

当mtDNA受到体内或外界造成的损伤时，会对线粒体氧化磷酸化功能造成不利影响，即可出现器官或组织功能异常，而较长时间异常功能状态的积累，就会造成细胞和生物体的衰老，与此同时，生物体在发生衰老现象时，线粒体氧化磷酸化功能减退，呼吸链酶复合体活性在各种组织中都有所下降，从而产生过多的活性氧(ROS)，而ROS的大量堆积又会对mtDNA本身造成损伤，这就导致了衰老机体的恶性循环。电子传递链中产生的超氧阴离子基团通过各种生化反应生成过多的ROS，氧化应激可能引起电子传递链组分和mtDNA损伤，ROS可损伤血管内皮和平滑肌细胞，与动脉粥样硬化相关。在生命过程中mtDNA损伤和突变逐渐积累，直接引起细胞氧化磷酸化活性降低，导致ROS产物增多，ROS产物增多又引起mtDNA损伤和突变率增高，形成氧化损伤增多和功能下降的恶性循环，并最终一起死亡〔31〕。由此认为，线粒体的氧化反应和mtDNA遗传可能参与衰老和长寿的过程。

4结语

mtDNA的不稳定突变是衰老的重要因素之一。线粒体作为古老的细胞器广泛存在于真核生物细胞中，由于其较高的进化速率，已被作为DNA标记广泛应用于现代分子生物学研究。Osada等〔29〕提出线粒体与细胞核的互偿进化模型，即表面看来 mtDNA快速进化且积累一定的有害突变，但是 mtDNA只是为nDNA提供可选择的材料，mtDNA的有害部分会通过nDNA 的调控来减少其有害性，而一旦出现在选择作用下具有适应性的基因，将会从 mtDNA转移至nDNA，由此猜测mtDNA积累有害突变其实是生物适应性的更好体现。随着分子生物学技术的不断发展，应同时考虑线粒体编码和核基因编码的能量代谢相关基因在能量代谢适应性进化过程中的协调作用。利用基因水平研究为向导，从宏观的角度去验证基因与功能的关系将为探讨线粒体功能与分子进化的相互作用关系提供一个更为全面的视角。

动物的能量代谢绝大部分发生在线粒体，生物运动能力的进化与线粒体的进化密切相关。利用线粒体基因组的比较从能量代谢角度研究生物进化是一种有效手段。利用基因水平研究，从宏观角度去验证基因与功能的关系将会是分子进化研究的新角度。在病理学方面，人们发现许多疾病的发生都与mtDNA变异有关。线粒体是细胞内ROS的主要来源，线粒体或mtDNA受到氧化损伤可能缩短寿命，所以，线粒体的变性、突变和破裂都是细胞衰老的重要原因之一。抑制mtDNA的缺失突变，可能是延长机体寿命的重要突破口。

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〔2015-04-01修回〕

(编辑苑云杰/王一涵)

基金项目：陕西省自然科学基础研究计划项目(2012JQ3012)；中央高校基本科研业务费专项资金资助(GK201002042)

通讯作者：张敏(1975-)，女，副教授，硕士生导师，主要从事发育遗传学研究。

〔中图分类号〕Q344

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2796-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.109

第一作者：莫菲(1990-)，女，在读硕士，主要从事发育遗传学研究。