CRISPR/Cas9技术构建小鼠癌症模型的初步研究进展①

刘玉颖　杨文涛　杨桂连　王春凤

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118)



CRISPR/Cas9技术构建小鼠癌症模型的初步研究进展①

刘玉颖杨文涛杨桂连王春凤

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118)

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)首次在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因位点附近发现，后统一称为规律成簇间隔短回文重复序列，是在大多数细菌、古细菌中广泛存在的一类独特的DNA规律性重复序列[1]。Cas(CRISPR-associated)基因是位于CRISPR区域临近处的蛋白质编码基因,而且相对保守。Cas基因可与CRISPR转录出的RNA结合并形成核糖核蛋白复合物，在原核生物中发挥获得性免疫功能，使宿主获得抵抗噬菌体、质粒等外来DNA入侵的免疫能力。CRISPR/Cas技术是由RNA指导Cas核酸酶对靶向DNA进行特定修饰，能够共定位RNA、DNA和蛋白，因而拥有巨大的改造潜力。此外，也在研究人类疾病致病机理和治疗手段中起到了关键作用。最近，有研究对21种癌症类型开展大规模分析，并将与癌症有关的已知基因目录扩增了25%[2]，还有许多重要的癌基因有待进一步发现。而癌症小鼠模型可对癌基因组进行深入研究，因此，CRISPR/Cas9以其高效、准确的对特定基因进行敲除或修饰，已成为目前最具有临床与应用前景的基因编辑技术之一。

1　CRISPR/Cas9技术的主要原理

CRISPR/Cas9是RNA引导的DNA内切酶系统，Cas9内切酶形成两种复杂的天然RNA物种，分别为crRNA(CRISPR-derived RNA)和tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)[3]。crRNA通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合，形成双链RNA。指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点产生DNA双链断裂(DSBs)，由此实现对基因组DNA序列进行编辑。简言之，crRNA与tracrRNA可通过任意一个茎环序列连接产生一种合成单导向RNA(sgRNA)。其他确定靶序列特异性的关键因素是前间区序列邻近基序(PAM)，PAM紧邻基因组位点的靶位点，但并非是sgRNA序列的一部分。CRISPR/cas9产生的DNA双链断裂是通过非同源末端连接(NHEJ)或同源性指导修复(HDR)途径修复，导致不同的DNA序列突变。与传统的基因打靶技术相比[4]，采用核酸酶的方法，如锌指核酸酶(ZFN)，转录激活因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas，具有通过直接在受精卵修改染色体而产生转基因生物的优势，减少对雄性生殖能力的胚胎干细胞系的需要，为创造突变体动物节省成本、缩短时间[5,6]。尤其新近开发的CRISPR/Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的最新的基因组编辑技术，且与ZFN或TALEN等其他基因组编辑技术相比具有更显著的优点。与ZFN和TALEN在千百个碱基中筛选一个可用位点相比CRISPR/Cas9在基因组中每8个碱基就能找到一个可进行编辑的位置，扩大了使用范围。因此CRISPR/Cas9似乎有取代ZNFs与TALENs成为多数实验室首选基因编辑技术的趋势。这些新的基因编辑技术，使在不同物种的细胞系中产生靶基因突变和敲除成为可能，甚至整个生物体都可以不通过降解mRNA产物直接发生基因组突变。从而提高了基因组编辑的效率。

2　CRISPR-Cas9技术在构建小鼠癌症模型中的应用现状

传统的癌症小鼠模型主要依赖于转基因或同源重组的胚胎干细胞。在野生型囊胚注射转基因ES细胞，产生生殖系嵌合体改变，由此产生单基因敲除小鼠或双突变小鼠，但该方法昂贵、费时。此外，由于其他哺乳动物物种没有建立ES细胞系，因此该方法限制了对其他许多物种的研究[7]。要研究癌基因与抑癌基因，需要精确修饰基因组，以产生可供仔细检测的突变。这对美国国家卫生研究院(NIH)的癌症基因组图谱(TCGA)验证大量候选癌基因极为重要。TCGA旨在全面的描述突变和癌症基因组特征。因为癌症突变的子集可能与癌症演变是不相关的(所谓的“乘客基因”)，它对确定那些与癌症演变有关的候选基因(癌症驱动基因)进行功能验证是极其重要的。面对这样庞大、复杂的基因组，需要有一个简单、灵活的技术手段，构建一种具备在众多乘客基因突变点中识别功能癌症驱动基因突变的小鼠模型。

2.1基于不同递送载体的CRISPR-Cas9技术最近，癌症基因组项目已经确定了大量与癌症有关的基因组的改变，如缺失、易位、倒置[2]。然而，由于利用Cre-LoxP方法创建大型结构变化相当耗时，因而许多与癌症相关的结构变化的功能尚不清楚。虽然，小鼠模型的构建操作相对简单可行，对人类遗传性疾病的药物筛选和基因治疗具有指导意义。但是，要在小鼠模型中充分探讨癌症，寻找超越实体肿瘤的模型是极具挑战的。与此同时，CRISPR/Cas9基因编辑技术在小鼠癌症模型中也取得了突破性进展。例如，编码Cas9和sgRNAs的DNA质粒被单独或以复合物的形式传递到肝靶向肿瘤抑制基因p10和p53[10]，为肝癌研究奠定基础。有趣的是，基于腺伴随病毒(Adeno associated virus，AAV)的Cas9/sgRNA递送载体，以其非致病性、高效和简单的构建特点，已被用于靶向成年小鼠神经元的有丝分裂后期，旨在阐明影响认知及行为的复杂疾病遗传学。此外，这种Cas9/sgRNA递送载体技术也通过多重破坏候选基因为模拟脑癌提供了潜在的适用方法[11]。目前，已有用Cre-dependent Cas9技术建造基因敲入小鼠且用于对体内及体外的基因组编辑。使用这种方法，用单一AAV载体在肺中产生p53基因功能缺失突变、Lkb1基因突变以及HDR介导的KrasG12D突变，由此对肺腺癌的病理学进行模拟[12]。还有研究通过一个MuLE慢病毒载体转导原代培养的小鼠细胞，设计包含不同基因改变的肿瘤，同时诱导CRISPR/Cas9介导的抑癌基因敲除，并表明单独使用该方法或与生殖细胞遗传学方法相结合，可为培养哺乳动物细胞及建造小鼠模型提供新的实验遗传力[13]。

2.2CRISPR-Cas9技术筛选小鼠肿瘤功能失活基因遗传筛选是用于鉴定不同表型的基因的有力工具。现已有研究，用CRISPR/Cas9技术在一个全基因组范围内对肿瘤生长与转移的功能失活基因进行筛选[14]。 通过sgRNAs诱变处理一个非转移性小鼠癌细胞，并将其移植到免疫功能低下小鼠中，会发生突变细胞池迅速产生转移现象。且在肺转移性肿瘤及晚期原发性肿瘤中发现富集的sgRNAs可靶向一小部分基因，该发现表明特定的功能缺失突变可促进肿瘤生长和转移。而且突变对原发性肿瘤生长的影响与转移瘤的发生发展呈正相关。因此，在对体内癌症演变的基因表型系统分析方面，Cas9技术筛选是一种相对稳健的方法。

2.3CRISPR/Cas9技术介导EML4-ALK肺癌小鼠模型人类癌症的基因工程小鼠模型对剖析肿瘤发生的潜在分子机制必不可少，并为研究癌症药物的敏感性及耐药性提供强大的基础平台。CRISPR技术具有优于胚胎工程的转基因或同源重组技术的一些优点。它可通过对体细胞的一个子集诱导重排，由此产生的病变能更紧密的概括人类肿瘤形成的随机性。而且，染色体重排已被证明是引起人类几种类型癌症的主要原因[15]。 最近的研究报告表明CRISPR/Cas9系统在体外高频率诱导人类细胞系中靶向癌症相关的染色体重排方面极具应用潜力[16]。以EML4-ALK重排为例，有研究在人类非小细胞肺癌(NSCLC)的一个子集中检测到EML4-ALK致癌基因，且因这种基因对ALK抑制剂敏感而与临床相关，于是使用病毒介导的CRISPR/Cas9系统对成年动物的体细胞诱导特异性染色体重排，运用它来生成一个EML4-ALK肺癌小鼠模型[17]，此技术极大地扩展了我们用小鼠模拟人类及其他生物癌症的潜力。此外，用EML4-ALK驱动的新型肺癌小鼠模型验证了CRISPR技术可以适用于小鼠致癌基因工程染色体重排。并为深入研究通过EML4-ALK驱使肿瘤形成的分子机制、检测靶向药物治疗疗效及探讨体内耐药机制提供了极难得的机会。更显著地是，该方法只需要一个适当的病毒载体和无胚胎操作生成，可以很容易地适应在其他物种的染色体重排模型，包括非人类的灵长类动物，从而促进对肿瘤及体内治疗反应的种特异性差异的研究。

2.4CRISPR/Cas9技术的其他成果在过去的几个月里，已有科研小组证实CRISPR/Cas9技术对建造大型染色体改变及体外模型极具潜力。国内已有报道，南京大学的研究团队首先利用CRISPR/Cas9技术成功构建了1只定向敲除单拷贝外源基因嵌合鼠[8]，以此证明CRISPR/Cas9基因编辑技术在制作基因打靶小鼠中的可行性及Cas9蛋白在小鼠胚胎中的活性。而美国科学家用向小鼠的合子注射CRISPR和Cas9的RNA技术，成功构建了多基因敲除小鼠，以同样的方式注入到胚胎干细胞，取得了同时敲除5个内源基因，效率高达10%的成果[9]。

CRISPR已被用于产生多种转基因小鼠模型，基因敲除/敲入生殖细胞模型、体细胞基因组编辑模型、小鼠药物治疗模型等。CRISPR已被证明是染色体工程研究的一种实用工具，通过基因组编辑生成体外白血病细胞株模型并识别耐药基因。CRISPR也被用来通过同源性修复途径，修正疾病相关基因。与传统的Cre-LoxP方法相比，CRISPR能够产生限定的基因敲除、基因敲入小鼠模型，可更进一步探索癌症演变。

3　CRISPR/Cas9技术的潜在问题

近两年中，CRISPR-Cas9技术与癌症模型产生是科研领域的极大进步，尽管CRISPR/Cas9技术在介导基因失活方面提供优势，但在实验设置中也存在技术上的障碍。目前面临的主要障碍包括Cas9基因组编辑工具仍然需要后续的表型或基因筛选，通常需要选择比较少见的修饰细胞[18]；建立体细胞小鼠模型并在体内使用CRISPR/Cas9技术纠正致病基因的突变；改进CRISPR传递(蛋白或mRNA)、分裂Cas9以提高体内基因组编辑效率[19,20]；查找小尺寸Cas9蛋白替代物促进CRISPR病毒载体包装[21]。此外，虽已有报道表明CRISPR/Cas9在基因编辑上极具前景，但其安全性仍备受关注。精密小鼠模型要求最小限度的脱靶效应。于是，未来研究需侧重仔细评价CRISPR/Cas9的安全性。已有研究组开发出减少脱靶的基因组编辑技术，比如cas9 D10A核酸内切酶型sgRNA、偏移型sgRNA、顿挫型sgRNA和dcas9-FokI融合蛋白[22-25]。Cas9脱靶位点的全基因组分析已有报道[26]，监测脱靶效应将是发展此项技术极其重要的一步。

4　结语

随着大规模人类肿瘤基因组测序成功，如TCGA，使最终鉴定新的、明确的抑癌基因或癌基因的功能性研究变得迫在眉睫。CRISPR系统为建立肿瘤模型、探讨药物治疗及识别各种新的药物靶基因和抗性基因提供了一种快速、简便可靠的方法，癌症涉及抑癌基因与癌基因复杂的变化及突变，CRISPR系统用于建立与探讨肿瘤模型颇具前途。多种技术均使用CRISPR系统用于生殖细胞与体细胞基因组编辑的基因敲除、敲入、染色体重排模型，成功创造了基因敲除/敲入小鼠模型、实体瘤模型、白血病小鼠模型等不同的小鼠肿瘤模型。CRISPR与传统Cre-loxP方法相结合表明，建立精密小鼠模型以便深入了解肿瘤抑癌基因与癌基因协同作用这一努力方向极具希望。CRISPR也适合全基因组筛选确定耐药基因。CRISPR介导的基因组编码及基因筛选将促进癌症基因组学及功能研究。

在未来，CRISPR/Cas9系统将会更精细化调整，加速在体外、体内的基因组编辑以建立新的癌症模型以便深入了解复杂的抑癌基因与癌基因之间的互作效应。此外，以光诱导的dcas9为代表的新型Cas9融合蛋白具有新的特性，可赋予CRISPR额外的优势。用对体内RNA干扰相类似的方式，体内CRISPR筛选可鉴别新的癌症驱动基因[27]。除了优化CRISPR方法，我们还应拓宽CRISPR在基因治疗中的应用，从单基因突变到多基因修饰来精确编辑基因组，以期最终防治癌症、糖尿病等复杂的遗传性疾病。这种新技术将会继续变革现代生物学。此外，预想利用基因组编辑的方法构建更精细化的癌症小鼠模型，以了解个别癌症及确定治疗手段。优化癌症小鼠模型将为癌症的精确治疗铺平道路。

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[收稿2015-07-21修回2015-08-12]

(编辑许四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.032

刘玉颖(1988年-)，女，在读硕士，主要从事动物微生态与黏膜免疫的研究。

及指导教师：杨桂连(1978年-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事动物寄生虫免疫学研究，E-mail：yangguilian@jlau.edu.cn。

王春凤(1972年-)，女，博士，博士生导师，主要从事动物微生态与黏膜免疫的研究，E-mail：wangchunfeng@jlau.edu.cn。

Q789

A

1000-484X(2016)09-1384-04

①本文受国家“863”计划项目(2013AA102806，2011AA10A215)、国家自然科学基金项目(31272552，31272541，81170358)、教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-10-0175)、吉林省科技发展计划项目(20111816)和吉林省世行贷款农产品质量安全项目(2011-Y07)资助。