线粒体损伤及其在心肌细胞损伤中的作用



线粒体损伤及其在心肌细胞损伤中的作用

薛大忠赵自刚牛春雨

(河北北方学院微循环研究所，河北张家口075000)

关键词〔〕线粒体；心肌细胞；细胞凋亡

牛春雨(1967-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事创伤休克病研究。

第一作者：薛大忠(1982-)，男，硕士，讲师，主要从事创伤休克研究。

重度失血、严重缺氧或酸中毒及脓毒血症均可引起心脏能量代谢障碍，使循环功能急剧减退，组织器官微循环灌流严重不足，导致重要生命器官功能、代谢严重障碍，严重影响治疗及预后，成为危重患者死亡的重要原因之一〔1〕。线粒体损伤已成为心肌细胞结构损伤与功能障碍的基本环节〔2〕。关于线粒体在多种致病因素导致心肌细胞损伤与功能障碍中的作用，目前认为与呼吸链酶类变化、一氧化氮(NO)释放、钙超载、线粒体跨膜电位(△φm)下降、促细胞凋亡蛋白过表达、线粒体通透性转换孔(mPTP)开放等因素有关〔3〕。本文重点综述引起线粒体损伤的一些因素及其在心肌损伤中的作用。

1呼吸链酶类的变化

糖、脂及氨基酸在线粒体被氧化后释放能量，转变为三磷酸腺苷(ATP)分子末端高能键，为机体提供能量。因此，线粒体是细胞内呼吸和产生ATP的主要场所。与内呼吸作用相关的过程包括柠檬酸循环、三羧酸循环、电子传递、质子泵和二磷酸腺苷(ADP)磷酸化(即ATP合成)；直接影响内呼吸的酶包括呼吸链各种酶复合物、琥珀酸脱氢酶(SDH)，此外，细胞色素(Cyt)-c在线粒体呼吸链中也起着重要作用。呼吸链是线粒体氧化磷酸化的电子传递链，它位于线粒体内膜。呼吸链的电子传递由5个酶复合物构成(复合物Ⅰ～Ⅴ)，其中，复合物Ⅰ～Ⅳ是主要组成部分，其活性能直接或间接地反映线粒体的呼吸功能。在呼吸链的电子传递过程中，电子由复合物Ⅰ或Ⅱ通过泛醌依次传递给复合物Ⅲ、Cyt-c、复合物Ⅳ，2e最终传递给氧生成O2-，后者与基质中的2H+结合生成水。

1.1复合物Ⅰ即还原型辅酶(NAD)I-Q还原酶，又称为NADH脱氢酶，相对分子质量为88 kD，包含34条以上的肽链，分别由细胞核和线粒体两个不同的基因组编码构成，是电子传递链中3个质子泵中的第一个质子泵。它的作用是先与NADH结合并将NADH上的两个高势能电子转移到其核黄素-5-磷酸(FMN)辅基上，使NADH氧化，并使FMN还原，反应如下：NADH+H+FMN →FMNH2+NAD。接着辅基FMNH2上的电子又转移到铁-硫聚簇Fe-S上，最后，电子被传递给辅酶(Co)Q，由CoQ将电子转移到细胞色素还原酶(复合物Ⅲ)。

1.2复合物Ⅱ即琥珀酸-Q还原酶，嵌于线粒体内膜。完整的酶还包括柠檬酸循环中是琥珀酸氧化为延胡索酸的琥珀酸脱氢酶。还原型黄素二核苷酸(FADH2)作为该酶的辅基在传递电子时并不与酶分离，只是将电子传递给琥珀酸脱氢酶分子的铁-硫聚簇(含有2Fe-2S、3Fe-3S和4Fe-4S)。电子经过铁-硫聚簇又传递给CoQ，而进入电子传递链。琥珀酸-Q还原酶的CoQ辅基和NADH还原酶辅基具有完全相同的结构和性质。

1.3复合物Ⅲ即Cyt-c还原酶，由包含3个细胞色素和硫铁蛋白的两个单体以二聚体的形式存在。其作用是将电子传递给Cyt-c，传递过程通过CoQ被氧化还原的过程是释放质子来实现的，在线粒体内膜还原型CoQ被氧化为半醌，被复合物Ⅰ或细胞色素b还原为氢醌。一对电子传递到复合物Ⅲ中将有4个质子释放到膜间隙中，其中2个质子是CoQ转移的。

1.4复合物Ⅳ即Cyt-c氧化酶，是呼吸链的标志酶，也具有质子泵的作用，可将H+由基质抽提到膜间隙，通过血红素中铁原子的氧化还原变化，把Cyt-c的4个电子传递给还原的氧形成水，同时跨膜转运4个质子，是呼吸电子传递链的第4个中心酶复合物。质子的转运能够形成电化学势能差，从而被ATP合酶用于合成ATP。Cyt-c的4个电子在复合物Ⅳ催化过程中，都是通过Cyt-c氧化酶CuA和Cyta传递到Cyt a3-CuB双核中心，经过在中心发生的氧化、还原反应，整个反应将一个氧气分子还原为2个水分子。在缺血缺氧情况下，心肌细胞复合物Ⅳ活性下降，直接影响线粒体的氧化磷酸化过程，可导致线粒体呼吸链电子传递中断，减少ATP生成〔4〕。实验研究表明，急性低氧状态下，心肌细胞线粒体呼吸链的酶复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性显著降低；经过慢性间断低氧暴露后，三者活性显著提高〔5〕；提示急性低氧可使线粒体呼吸功能受损，从而引起心肌能量代谢障碍，这是急性低氧后心肌舒缩功能障碍的主要原因之一。

1.5Cyt-c表面带正电荷，存在于线粒体嵴上，与其他氧化酶排列成呼吸链，不能自由通过线粒体外膜，是生物氧化过程中的电子传递体。在酶存在的情况下，Cyt-c对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。生理条件下，Cyt-c不能进入细胞；缺氧引起细胞膜通透性增高后，Cyt-c便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用。在此同时，对细胞也发挥一定的损伤作用。研究表明，从线粒体中泄露出的Cyt-c能够诱导细胞凋亡；实验显示，多种细胞凋亡伴随着胞质中Cyt-c释放，而敲除了Cyt-c基因的细胞对凋亡具有明显的耐受性，可见，Cyt-c是线粒体介导细胞凋亡途径中不可缺少的重要因子〔5～7〕。病理状态下，Cyt-c通过内膜释放到胞质，为复合物Ⅳ传递电子数量减少，导致电子载体超载，尤其是复合物Ⅰ和Ⅲ〔8〕。电子被迫从呼吸链中释放出来与O2产生超氧阴离子，进一步积累后可形成过氧化氢(H2O2)和其他活性氧(ROS)。ROS过量可氧化脂质、DNA和蛋白质，促使各种酶失活，这些损害最终导致细胞凋亡或坏死〔9，10〕。ROS的脂质氧化作用能进一步破坏线粒体内膜，促进Cyt-c释放到胞质；ROS又能通过与线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道、Bcl-2蛋白家族的相互作用，促进Cyt-c向胞质释放。这样，Cyt-c与ROS形成了正反馈〔11〕。

1.6琥珀酸脱氢酶属黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶，由含有黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和2个铁硫簇的α和含有一个铁硫簇β两个亚基组成，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，与Cyt-c氧化酶同为线粒体氧化的标志酶，可作为评价三羧酸循环运行程度的指标。该酶以FAD作为其脱下电子的受体，而不是NAD+。琥珀酸脱氢酶与FAD以共价键连接，因此，它们是酶和辅基的关系。它使琥珀酸氧化为延胡索酸过程中所产生的FADH2与酶结合，将来自FADH2的两个电子直接传递给酶的Fe3+。尽管琥珀酸脱氢酶的作用是专一的，但丙二酸(与底物结构上很相似)可以与该酶结合，使其不能发挥催化作用脱氢，因此，丙二酸是琥珀酸脱氢酶的强抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸的脱氢具有严格的立体专一性。琥珀酸脱氢酶与柠檬酸循环中的其他酶不同，是唯一嵌入到线粒体内膜的酶，是线粒体内膜的一个重要部分，其他酶大多存在于线粒体的基质〔12，13〕。

2NO

NO可与氧自由基、血红蛋白、超氧自由基反应，在不同位置发挥不同作用。低浓度时，NO可形成亚硝酰基血红素复合物，促进环磷酸鸟苷形成，进而激活相关蛋白激酶抑制Ca2+内流，促进血管扩张，改善微循环；可通过亚硝酸化减轻钙超载所致的毒性，减少细胞毒性物质的生成，起到保护作用。然而，高浓度的NO及其衍生物又可抑制DNA的修复与合成，引起核酸的亚硝酰化反应，导致DNA断裂；可抑制线粒体呼吸链产生ATP，造成上皮细胞通透性增加；在心肌细胞中，NO可抑制线粒体呼吸甚至可引起心肌坏死〔14〕。

研究表明，在心肌线粒体中也有较低含量的神经型NO合酶(NOS)(nNOS)存在〔15〕，能够与Cyt氧化镁耦联从而促进NO对心肌线粒体的抑制，位于心肌线粒体内的精氨酸酶可清除NOS底物，其特异性抑制作用可增加nNOS的活性，从而抑制心肌收缩。活化后nNOS在肌浆网通过ryanodine受体刺激钙内流而增加心肌收缩力。内皮型NOS(eNOS)则可在细胞穴样凹陷上与β3肾上腺素能受体耦联，通过L-型钙通道而抑制β-AR引起的心肌收缩。由此可见，nNOS和eNOS合成NO是在特定部位，与局部产物相关的，在心脏中具有不同的功能。由于肌浆网比细胞膜穴样凹陷更加靠近线粒体，因此，nNOS介导产生的NOS更容易进入线粒体，影响内皮组织的线粒体。诱导型NOS(iNOS)在正常情况下心肌细胞不表达，但在炎症、缺氧、再灌注等高损伤时有高表达，高表达的iNOS持续介导高水平NO，从而抑制心肌细胞线粒体呼吸功能来减弱肌肉收缩和氧耗速度。

2.1抑制线粒体呼吸链NO对Cyt氧化酶(复合物Ⅳ)具有快速的可逆性抑制作用，同时，所产生的活性氮(RNS)产物可对线粒体呼吸链中的多种组分产生缓慢而又不可逆的抑制作用。NO与亚铁血红蛋白的高亲和力，导致NO与血红蛋白(Hb)的亲和力是一氧化碳(CO)的1 000倍，在血液中能迅速形成亚硝基Hb，纳摩尔水平的NO便可快速可逆地抑制复合物Ⅳ，减弱后者与氧的结合能力。这种抑制作用是NO通过与血红素a3的铁离子和CuB中的铜离子结合后生成a32+-NO+和CuB-NO+两种复合物，水合后形成亚硝酸盐〔16〕。其中NO与铁离子的结合可在光的作用下逆转，而与铜离子的结合不可逆转。此外，NO还可用过对呼吸链中的修饰来持续抑制线粒体呼吸，通过硝基化或硫基亚硝基化等方式抑制Cyt-c传递电子的功能。NO对线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的抑制作用缓慢而持续，硝基化或硫基亚硝基化可灭活复合物Ⅰ，复合物Ⅱ中的硫铁键可被高水平的RNS所破坏，复合物Ⅲ的活性可被NO可逆性抑制，但具体机制尚未阐明。

2.2抑制三羧酸循环NO通过硫基亚硝基化产生过亚硝酸盐，抑制线粒体中的顺鸟头酸酶，进而影响三羧酸循环产生能量〔17〕。NO可通过硫基亚硝基化抑制肌酸激酶生物学功能，从而影响ATP运输和再生，还可通过可溶性鸟苷酸环化酶-环磷酸鸟苷信号途径调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子(PGC)-1α转录，进而调节线粒体生物合成，使得Cyt-c和Cyt-c氧化酶的表达及线粒体数目都显著增加，而PGC-Ⅰ、RNF-1和mtTFA的表达明显上调〔18〕。

2.3促进mPTP开放过亚硝酸盐和亚硝基硫醇可作用于mPTP引起线粒体膜通透性增加，NO本身也可通过抑制线粒体呼吸和降低△φm来促进孔的开放。然而，NO还可通过活化可溶性鸟苷酸环化酶使蛋白激酶G活化，后者可使mPTP的部分蛋白质磷酸化，使得孔的开放频率降低。调节细胞内钙浓度及活化线粒体内ROS产物也可间接影响到孔的开放状态。mPTP过性开放可引起线粒体内膜明显肿胀，外膜破裂，促凋亡因子如Cyt-c，凋亡诱导因子等释放并启动细胞凋亡程序。长时间开放则可引起线粒体膜电位去极化，氧化磷酸化解耦联，ATP合成障碍，最终导致细胞坏死。

3钙超载

钙离子(Ca2+)对于维持细胞的动作电位、神经传导功能、肌肉伸缩与舒张功能及神经-肌肉传导功能，具有重要的作用。Ca2+是调控心肌细胞线粒体呼吸功能的重要机制，其浓度的变化可调整线粒体氧化磷酸化功能。

3.1Ca2+在心肌细胞内的调节线粒体摄取Ca2+是通过内膜电位差和Ca2+浓度差实现的，三羧酸循环产生NADH等建立H+浓度差，从而形成膜两侧电位差用于电子链传递以合成ATP。Ca2+内流减少电位差，从而调节膜两侧电位差，进而调节ATP的合成。Ca2+的外流是通过与Na+交换完成的，这种方式被称为依赖性外流，在心脏和脑中是主要的外流方式。摄取与外流使Ca2+在心肌细胞线粒体中处于循环状态，生理状态下，心肌细胞的肌浆网是胞内参与Ca2+调节最主要的细胞器。当心肌缺血后，细胞游离Ca2+水平的升高一是通过ATP降解造成腺苷释放而激活蛋白激酶C，导致ATP敏感性钾通道开放延长，在电压调节下，Ca2+通道开放延长造成的；二是Na+浓度的升高伴随着上述反应，Ca2+/Na+交换蛋白的活性受跨膜Na+浓度梯度的调节，从而导致细胞内Ca2+超载。实验研究发现，休克复苏后Ca2+明显升高是再灌注损伤使细胞膜通透性增强，同时也伴随着Ca2+/Na+交换增强，使心肌合成ATP功能受到影响。大量活性氧产生，细胞内Ca2+水平升高，使再灌注阶段的细胞凋亡比单纯缺血阶段更为显著〔19〕。缺氧状态下，在氧化磷酸化功能严重受损时，线粒体可能成为调节心肌细胞内Ca2+含量最主要的细胞器。肌浆网摄取钙离子的能力远不如线粒体，因此当胞质游离钙浓度增加时，线粒体摄钙速度远大于释钙速度，导致线粒体内钙积聚，但是线粒体钙积聚的能力并不是无限的，过多的钙沉积会导致线粒体功能紊乱。

3.2钙超载损伤心肌细胞的机制钙超载与氧自由基损伤是引起心肌缺血缺氧损伤的重要发病环节，尤其是在缺血再灌注损伤中，二者的联系较为密切。大量氧自由基的产生可直接损伤细胞膜从而加速Ca2+内流，又能通过抑制钙泵活性来抑制胞质钙浓度降低。Bolli等〔20〕认为再灌注初期，大量氧自由基对组织损伤起主要作用，在随着损伤的进展及Na+-Ca2+交换，Na+通过缺氧时H+-Na+交换泵出胞内H+，使胞内Na+升高来促进Ca2+交换，导致钙超载，钙超载对心肌细胞的功能障碍和坏死发挥主要作用。

到目前为止，人们发现只有在缺氧等病理条件下，线粒体才与Ca2+发生关系，当Ca2+在缺氧心肌内过量涌入并危及心脏功能时，线粒体“开启”其钙库功能；就心肌细胞内线粒体的数量和总体而言，它无疑是心肌细胞内最大的“Ca2+库”。但Ca2+在线粒体内的储积，使线粒体消耗大量ATP；同时，线粒体内Ca2+与含磷酸根的化合物形成磷酸钙，干扰线粒体的氧化磷酸化，使ATP生成减少，引起能量代谢障碍。细胞内Ca2+超载可激活多种磷脂酶，促进膜磷脂分解，损伤生物膜；膜磷脂的降解产物花生四烯酸、溶血磷脂等增多，增加了膜通透性，加重膜的功能紊乱。同时，细胞内钙超载使Ca2+依赖性蛋白水解酶活性增高，促进黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，使自由基生成增多，损害心肌细胞。

4Δφm降低

线粒体内膜通透性较低，保证了线粒体基质内环境稳定。当电子经过呼吸链传递过程中，伴随H+由线粒体基质内通过质子泵泵出到膜间隙，H+在膜间隙积聚，从而建立△φm。△φm是反映细胞线粒体功能状态的重要参数之一，既能驱动线粒体合成ATP，又能在细胞耗能增加时，促进信号钙进入线粒体，加速线粒体合成ATP；同时，△φm也是监测线粒体内膜通透性的指标之一。

4.1线粒体△φm降低的机制质子泵学说认为，线粒体内膜外质子通过F0亚基上的质子通道回流产生的势能为ADP磷酸化提供能量，如果这个机制发生障碍必将使△φm降低。

4.2△φm降低与细胞凋亡的关系△φm消失标志着一个不可逆转的凋亡过程。有研究表明，△φm消失可引起Cyt-C从线粒体释放出来，诱导细胞凋亡；同时，△φm下降早于DNA断裂和磷脂酰丝氨酸(PS)外翻〔21〕，提示△φm下降为凋亡早期阶段，通过抑制△φm下降抑制细胞凋亡，说明△φm下降为凋亡的特异性改变。也有研究表明，凋亡细胞PS外翻早于△φm降低及Cyt-C释放，提示PS外翻可能独立于线粒体，引起细胞凋亡，尚待进一步研究〔22〕。

5mPTP

mPTP是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，是一种非特异性通道，其分子组成尚未完全清楚。目前，多数学者〔23〕认为mPTP由外膜的电压依赖的阴离子通道(VDAC)、内膜的腺嘌呤核苷酸转位酶(ANT)及亲环素(Cyp)D等组成。生理状态下，mPTP呈周期性开放，对维持线粒体功能有着重要的意义；缺血、缺氧等条件下，mPTP在细胞凋亡的发生过程中扮演着重要角色。

5.1诱导mPTP开放的因素缺血/再灌注后，多种因素可导致mPTP开放，但影响最大的是钙超载和氧自由基大量生成。Ca2+诱导mPTP开放是通过与其金属位点和实现的，另外线粒体内的钙超载可致使ANT构型改变，导致mPTP高水平开放；过氧化物则是通过氧化mPTP上的硫醇，引起mPTP开放。mPTP开放在不同阶段由不同因素起主导作用。缺血期，细胞内钙超载起主导作用；再灌注早期，产生的大量自由基起关键作用；再灌注晚期，Bcl-2/Bcl-xL和Bax的比例决定了mPTP开放。也有学者发现在缺血期间，标记的脱氧葡萄糖(DOG)无法进入线粒体基质，再灌注期DOG明显增多，而推测缺血早期mPTP是关闭的；但可以确定，mPTP开放发生在再灌注期，而且在决定细胞坏死中起关键作用〔24〕。

5.2mPTP开放产生的效应当mPTP开放后，一方面引起线粒体内膜通透性增加，使胞质中的大量正离子进入线粒体，进而引起△φm降低，导致部分ATP被用来恢复质子梯度，加重细胞耗能；另一方面降低ATP合成的驱动力，减少ATP合成，引起能量代谢障碍。同时，由于Ca2+在线粒体内不断积聚，加重钙超载，从而引起线粒体损伤甚至细胞坏死或凋亡；另外，mPTP开放可导致线粒体基质膨胀引发外膜破裂，促使大量凋亡蛋白和细胞凋亡诱导因子(AIF)释放，促使细胞坏死。在轻度缺血或仅限部分线粒体mPTP开放时，再灌注后随着线粒体功能的恢复，细胞死亡是可能避免的。但是，如果线粒体损伤达到一定程度，会使细胞出现不可逆性损伤。因此，mPTP是决定细胞死亡机制的阀门。

6凋亡蛋白

在线粒体膜及膜间隙中存在半胱氨酸基天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)、Bcl-2蛋白家族、ANT、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)等可调控和促进细胞凋亡发生的相关蛋白。线粒体介导心肌细胞凋亡的机制与这些蛋白的表达与释放密切相关。

6.1Caspase的激活与效应Caspase是一类蛋白酶家族，目前有10种不同的Caspase，各种Caspase都富含半胱氨酸。生理条件下，每一种caspase都是以非活性状态存在的，其肽链比有活性时长一些；致病因素作用于细胞，可将多出的部分切除，使其转变为有活性的Caspase，可切割靶蛋白的特异天冬氨酸残基，引起凋亡。同时，Cyt-c释放到胞质后，发生亚硝基化或不发生亚硝基化，与dATP、Apaf-1、procaspase-9聚合成为凋亡体，激活procaspase-9与Caspase-3，从而导致细胞凋亡〔25，26〕。

6.2ANT对线粒体功能的调控ANT位于线粒体内膜，是线粒体基质与胞液转换ATP与ADP的载体，其活性与线粒体内ATP含量呈协调变化。急性缺氧状态下，ANT转运活性下降，表明ATP转运效率下降；随着缺氧时间延长，虽然线粒体氧化磷酸化仍处于低水平，但ATP含量部分恢复，可能与ATP消耗和转化减少有关；进一步延长缺氧时间，线粒体ATP含量和ANT转运活性进一步下降。

6.3Bax与Bcl-2表达Bax与Bcl-2是同一家族但功能相反的两组基因，在细胞周期的调控中是通过二者结合后形成的二聚体来发挥作用的，在二聚体中，两者的比例决定促凋亡特性。当Bcl-2蛋白表达减少或Bax蛋白表达增加时，促使细胞凋亡；当Bcl-2蛋白表达增加或Bax蛋白表达减少时，则抑制细胞凋亡。目前认为Bax与Bcl-2的表达是通过Cyt-c进入线粒体后激活Caspase-3而引起的。

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〔2014-10-19修回〕

(编辑杜娟)

通讯作者：赵自刚(1974-)，男，硕士，教授，硕士生导师，主要从事创伤休克病研究。

基金项目：河北省高校百名创新人才支持计划(Ⅱ)；河北省人才培养工程资助计划；河北北方学院创新人才培育基金(CXRC1314)

中图分类号〔〕R363.2〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0223-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.103