纳米材料诱导细胞死亡的研究进展

贾 健，李艳博，郭彩霞（首都医科大学公共卫生学院，北京100069）

纳米材料诱导细胞死亡的研究进展

贾 健，李艳博，郭彩霞
（首都医科大学公共卫生学院，北京100069）

随着纳米材料在生物医药、材料化工等众多领域日益广泛的应用，纳米材料环境暴露及其引发的细胞毒性效应受到了研究人员的高度关注，成为纳米毒理和纳米医药研究领域中一个新的研究方向。纳米材料的毒性作用研究不仅为纳米材料的安全性评价提供了理论依据，而且有助于进一步扩展纳米技术的应用领域。本文重点阐述纳米材料在细胞自噬、凋亡和坏死中的作用，并探讨纳米材料诱导不同细胞死亡方式的可能机制，为纳米材料的毒性研究和安全性评价提供参考。

纳米材料；细胞死亡；细胞凋亡；自噬；坏死

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.04.018

纳米材料由尺寸在1～100 nm之间的纳米粒子组成。通常将三维都在纳米尺度的纳米材料称为纳米颗粒。凭借尺寸小、比表面积大、吸附能力强和化学反应活性高等理化性质，纳米材料被广泛应用于生物传感、医疗诊断、造影成像、药物运输等领域。大量研究表明，多种纳米材料具有细胞毒作用，可诱导细胞死亡。一般来说，纳米材料进入细胞需要先穿越细胞膜，通过被动扩散或内吞作用，在细胞中释放、扩散并分布在细胞质或多种细胞器中［1］。在此过程中，纳米材料可能会生成活性氧（reactive oxygen species，ROS）导致氧化应激，聚团沉淀，或形成相应的离子（如金属氧化物）破坏细胞器或细胞结构，并与生物大分子及其他分子相互作用，影响细胞正常功能，造成毒性损伤，导致细胞死亡。本文按照细胞死亡结局的类型，对纳米材料诱导细胞死亡的方式及其可能的分子机制进行综述。

1　纳米材料与细胞自噬

细胞自噬是在细胞质中形成的双层或多层膜结构的自噬小体通过和溶酶体融合对包裹的内容物进行降解的过程，是细胞程序性死亡的执行方式之一，主要有3种形式：大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬。自噬在某些情况下会保护细胞，但在另一些情况下会引起细胞损伤，导致细胞发生自噬性细胞死亡［2］。近来，从细胞自噬角度，探讨纳米材料可否用于控制某些恶性肿瘤、神经退行性疾病的发展或作为疾病治疗干预策略，受到了广大学者的关注。已有研究表明，有的纳米材料可选择性诱导肿瘤细胞发生自噬；C60富勒烯-己酮可可碱复合纳米材料能通过增强自噬效应消除β-淀粉样多肽引发的细胞毒性［3］。不过，纳米材料在正常细胞中引发的自噬可能产生细胞毒性，需要加以规避。

1.1金属纳米材料与细胞自噬

绝大多数金属纳米材料引起的细胞自噬是促进细胞死亡，如纳米金能诱导细胞自噬，同时细胞发生氧化损伤，细胞内脂质过氧化产物以及抗氧化和氧化应激相关因子表达量显著升高［4］；但某些情况下，纳米材料引起的自噬促进细胞存活，自噬可能是细胞的一个自我防御机制。有研究发现，阻断纳米银诱导的自噬体形成，可导致细胞凋亡［5］，且阻碍线粒体自噬会引起损伤线粒体的聚集，细胞能量代谢受影响［6］。纳米金能诱导细胞自噬，且其诱导的细胞内自噬体的积累或自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）Ⅱ表达量的升高是由于自噬流阻断引起的［7］。溶酶体的功能紊乱可能与自噬流的阻断有联系。被细胞吞噬的纳米金最终积聚在溶酶体内，使其碱化从而破坏其降解能力。还有研究发现，纳米金可通过ROS抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B （protein kinase B，又名Akt）/哺乳动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白〔mammalian target of sirolimus （Rapamycin），mTOR〕信号通路，诱导低氧处理的人近端肾小管上皮细胞HK-2发生自噬性死亡，但正常HK-2细胞可通过自噬体的形成而免受纳米金的毒性［8］，提示在使用纳米颗粒进行生物医药相关的研究及应用中必须要考虑到细胞状态。

1.2纳米氧化物与细胞自噬

稀土金属氧化物被认为是自噬诱导剂［9］，同样普通常见的氧化物纳米材料也能在一定程度上引起自噬的发生。研究发现，氧化锌（zinc oxide，ZnO）纳米颗粒的毒性由Zn2+的释放所介导，自噬是其诱导细胞死亡的主要方式之一［10-11］。体内外研究表明，ZnO纳米颗粒表面释放的Zn2+可引起胞内ROS大量升高，上调自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和自噬蛋白5（autophagy protein 5，Atg-5），促进自噬体形成而诱导死亡并呈剂量依赖性加重［12］。而阻断细胞摄取Zn2+或提供抗氧化剂或自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）可抑制ZnO纳米颗粒诱导的自噬［13］。

除ZnO纳米颗粒外，包括氧化铁（iron oxide，Fe2O3）、四氧化三铁（ferroferric oxide，Fe3O4）、氧化铜（copper oxide，CuO）、氧化铝（aluminum oxide，Al2O3）、二氧化硅（silica dioxide，SiO2）以及二氧化钛（titanium oxide，TiO2）等在内的多种纳米氧化物均可诱导细胞自噬，如：Fe3O4纳米颗粒可通过增加Beclin 1和Atg14并降低Bcl-2的含量促进自噬起始复合物的形成，呈时间浓度依赖性增加LC3Ⅱ并减少P62，引发血细胞自噬［14］。不过，不同氧化物纳米颗粒对细胞的毒性效应及诱导细胞自噬的能力不同。有研究评估了CuO，SiO2，TiO2，Fe2O3和Fe3O4纳米颗粒对肿瘤细胞的毒性效应［15］，结果只有CuO纳米颗粒显示出明显的细胞毒性，导致细胞中自噬体积累、LC3Ⅱ表达升高，而加入3-MA可显著提高细胞活力。

1.3纳米材料诱导细胞自噬的可能机制

纳米材料诱导细胞自噬所涉及的分子机制尚处于研究阶段，且不同纳米材料不尽相同。Khan等［16］发现，Fe2O3纳米颗粒能选择性地通过Akt/腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphateactivated protein kinase，AMPK）/mTOR通路诱导肿瘤细胞发生自噬，从而显著杀伤肿瘤细胞而对正常细胞不具有毒性效应。新近研究显示，血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）相关的自噬活化通路，可能在维持细胞内环境稳定和清除异物方面起重要作用。研究表明，SiO2纳米颗粒可通过VEGFR2/ PI3K/Akt/mTOR和VEGFR2/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated pro⁃tein kinases，ERK1/2）/mTOR信号通路引起人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）自噬［17-18］，还可通过氧化应激引发人肝癌细胞HepG2出现细胞自噬性死亡［19］。同样，锰纳米颗粒诱导产生的ROS及其引起的氧化应激和线粒体损伤相关凋亡信号对自噬的产生起一定的作用［20］；羧基化单壁碳纳米管诱导人肺腺瘤细胞A549自噬体产生依靠的是Akt/结节性硬化症复合物1/2（tu⁃berous sclerosis complex，TSC1/2）/mTOR通路［21］。此外，细胞骨架的紊乱可影响细胞内囊泡的转运，纳米材料对细胞骨架的影响也可能是自噬功能紊乱和自噬体堆积的机制之一。研究发现，Fe2O3纳米颗粒可使HUVEC细胞中肌动蛋白和微管蛋白的骨架网络排列混乱，导致自噬功能损伤［22］。SiO2纳米颗粒也可诱导细胞骨架的断裂，并伴有线粒体的去极化和自噬体的堆积［18］。

2　纳米材料与细胞凋亡

细胞凋亡是由基因控制的细胞主动程序性死亡，与组织发生、器官细胞稳定的维持、免疫以及肿瘤、自身免疫性疾病和衰老等的发生密切相关。纳米材料是否对细胞凋亡过程产生特殊的影响，是近年来纳米医学研究的重要问题之一。研究发现，无论是正常细胞还是肿瘤细胞，纳米材料均有引发其凋亡的报道。不过，某些纳米材料在一定条件可抑制细胞凋亡。有研究发现，单壁碳纳米管在一个长达6个月的慢性暴露实验中，表现出通过活化Akt/ P53/Bcl-2信号通路并下调Bax和Noxa的表达而使肺上皮细胞抵抗细胞凋亡，阻断细胞发生恶变［23］。

2.1金属纳米材料与细胞凋亡

大量研究表明，纳米银、纳米金和纳米铜等金属纳米材料具有促细胞凋亡作用。纳米银可诱导体外培养的多种细胞发生凋亡，包括宫颈癌细胞、表皮角质细胞［24］和巨噬细胞［25］等，还能诱导囊胚期内细胞团和滋养外胚层细胞发生凋亡，进而抑制胚胎细胞增殖［26］。体内实验观察到纳米银可诱导瑞士白化（swiss albino）小鼠肝细胞出现凋亡现象，可能与其诱导DNA损伤有关［27］。纳米金可造成HL-7702细胞脂质过氧化，使细胞发生氧化应激，降低线粒体膜电位，诱导细胞凋亡［28］；也可因胞质分裂阻滞（细胞分裂障碍）而导致细胞凋亡［29］。纳米铜通过线粒体机制引起一种石斑鱼（Epinephelus coiodes）的肠上皮细胞凋亡［30］。

2.2纳米氧化物与细胞凋亡

ZnO纳米颗粒可诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。研究显示，ZnO纳米颗粒可诱导HepGⅡ细胞内P53、Bax表达上调，Bcl-2表达下降，活化胱天蛋白酶3，造成DNA片段化，产生ROS引发氧化应激［31］。Fe3O4纳米颗粒可诱导肝细胞HL-7702发生氧化应激、DNA损伤和细胞凋亡［32］，还可通过氧化应激激活JNK和P53信号通路，导致神经细胞发生细胞周期紊乱和凋亡［33］。CuO纳米颗粒也可通过ROS大量生成诱导肾上皮细胞DNA损伤，最终导致以凋亡方式为主的细胞死亡［34］，还可通过增加胱天蛋白酶3的活性诱导细胞凋亡［35］。二巯基丁二酸包被的Fe2O3纳米颗粒可引起人主动脉血管细胞中促凋亡和抑凋亡基因表达发生改变，激活氧化应激相关基因和黏附分子表达，抑制血管生成［36］。至于非金属氧化物纳米颗粒，SiO2纳米颗粒可进入线粒体，激活线粒体介导的细胞凋亡通路［37］。还有研究用SiO2包被的MnO纳米颗粒处理鼠纤维细胞L929，发现这种混合纳米颗粒首先在胞内产生大量ROS，随后使得Bax/Bcl-2比值增高，引起P53活性增加，最终引起G2/M期阻滞、胱天蛋白酶3活性增加，导致凋亡［38］。

2.3纳米材料诱导细胞凋亡的可能机制

虽然对于纳米材料诱导细胞凋亡进行了较多的研究，但纳米材料引起细胞凋亡的原因尚无完善的理论机制。而且，纳米材料可能是通过多种途径来诱导细胞凋亡，具体以哪种途径为主，也会受到纳米材料的粒径、形状、表面性质和细胞类型等众多因素的影响。

2.3.1氧化应激途径

近年来研究发现，损害抗氧化系统和氧化应激是纳米材料诱发凋亡的主要机制。纳米材料可能通过产生大量的ROS引起氧化应激。如CuO纳米颗粒作用于小鼠海马趾细胞HT22，可呈时间-浓度依赖性下调谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽转移酶的活性以及谷胱甘肽的表达，破坏抗氧化系统，导致大量ROS聚集，引起Bax/Bcl-2比值增高，导致凋亡［39］，若在CuO纳米颗粒处理前给予具有抗氧化活性的藏红花酸（crocetin）可使细胞免于这种毒性损伤。同样，TiO2［40］和Fe2O3［41］纳米颗粒可通过ROS诱导细胞凋亡。

2.3.2线粒体途径

线粒体是细胞能量工厂，在细胞凋亡过程中发挥重要作用。ROS的大量生成可直接或间接作用于线粒体，诱导线粒体损伤。多种纳米材料均可诱导线粒体损伤，进而通过线粒体途径介导细胞凋亡。研究显示，TiO2纳米颗粒在胞内破坏抗氧化系统，产生大量ROS导致线粒体功能障碍是其诱导神经细胞凋亡的机制之一［42］。纳米镍作用于HepGⅡ，可通过产生大量ROS引起线粒体膜电位改变，进而通过线粒体途径诱导胱天蛋白酶3活性增加，上调P53及Bax/Bcl-2比值，使细胞周期阻滞于G0/G1期，导致细胞发生凋亡［43］。纳米银也通过ROS相关线粒体应激途径使小鼠胚胎成纤维细胞发生凋亡［44］。

2.3.3内质网应激途径

正确折叠和聚集蛋白、合成脂类和固醇以及储存Ca2+等都离不开内质网的稳态。胞内未折叠蛋白的大量聚集可引起内质网应激（endoplasmic re⁃ticulum stress，ERS）。ERS通常很快恢复稳态，但长时间ERS则可通过CHOP和JNK通路引起凋亡。近年来研究也发现，纳米材料可通过ERS途径诱导细胞凋亡。ZnO纳米颗粒可诱导ERS信号通路活化，表现为糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、二硫键异构酶（PDI）、X盒结合蛋白1（X box binding protein1，XBP 1）、真核起始因子2（eukaryotic initiation factor 2ɑ，eIF2ɑ）和蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）含量增多，进而促进胱天蛋白酶3，9和12活化，c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-termi⁃nal kinase，JNK）和CHOP等被磷酸化，且Bax被上调，最终导致小鼠肝细胞凋亡［45］。若沉默CHOP表达，可降低ERS强度，进而减弱纳米银诱导的细胞凋亡［46］。

2.3.4死亡受体途径

个别研究报道显示，死亡受体Fas/FasL途径可能参与纳米材料诱导的细胞凋亡过程。Choi等［47］研究发现，量子点能引起神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞表面Fas的表达上调，增加细胞膜的脂质过氧化，从而导致细胞功能损伤。另外，氧化钴纳米颗粒对淋巴细胞的损伤中，通过产生大量的ROS诱导TNF-ɑ合成，随后通过胱天蛋白酶8/P38/胱天蛋白酶3通路诱导细胞凋亡［48］。

2.3.5其他途径

纳米银进入细胞后，大量聚集在胞质和核内，除通过胱天蛋白酶依赖途径诱导细胞凋亡外，还可通过非胱天蛋白酶依赖途径诱导细胞凋亡，这主要与细胞凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）和P38 MAPK的转移有关［49］。除MAPK通路外，P53通路也参与纳米材料诱导的细胞凋亡。Hori等［50］研究发现，氧化镍纳米颗粒经P53通路诱导细胞凋亡，同时去乙酰化酶1沉默信息调节因子（silent information regulator 1，sirtuin 1）的表达受抑制。sirtuin1是一种NAD+依赖性脱乙酰基酶，可使P53等发生脱乙酰基。进一步研究发现，过表达sir⁃tuin1可抑制氧化镍纳米颗粒诱导的细胞凋亡作用［51］。

从上述研究可见，ROS介导的氧化应激、线粒体途径、死亡受体途径、内质网途径以及P53、MAPK等信号通路在纳米材料诱导细胞凋亡过程中均发挥一定作用。不过，细胞凋亡途径并非独立，而是交织在一起的，有效地放大了凋亡信号。如TiO2纳米颗粒可诱导小鼠海马趾神经元细胞内Ca2+浓度升高、线粒体膜电位降低，上调促凋亡蛋白细胞色素c、Bax、胱天蛋白酶3和12的表达，并减少抑凋亡蛋白Bcl-2表达，可见TiO2纳米颗粒可通过线粒体和内质网两条途径诱发神经细胞凋亡［52］。同样，ZnO纳米颗粒通过ERS和氧化应激途径使肝细胞发生凋亡［45］。

3　纳米材料与细胞坏死

细胞坏死是细胞受到强烈刺激而发生的死亡现象。因坏死过程不需要合成新蛋白、低耗能，且不受稳态机制调控，属于被动性死亡。在生理和病理过程中均可有细胞坏死存在，而且细胞凋亡和坏死常发生在同一生理或病理学过程中。目前对于细胞坏死信号通路的了解甚少，纳米材料诱发细胞发生坏死的机制尚不清楚。细胞内的ATP含量的降低、高浓度的ROS和Bcl-2大量表达引起的Bcl-2家族蛋白表达的失衡、胱天蛋白酶活性受到抑制等都可能会引发细胞坏死。Pan等［53］研究发现，纳米金可通过氧化应激和线粒体损害诱导细胞坏死而发生死亡。单分散的非晶体球形硅纳米颗粒主要是通过坏死方式诱导内皮细胞EAHY926发生死亡［54］。SiO2纳米颗粒包裹了Ce3+后，可极强地诱导人外周血细胞发生坏死［55］。

4　纳米材料诱导的细胞自噬、凋亡和坏死之间的联系

纳米材料的毒性作用表现在可诱导细胞以不同的方式发生死亡，但各细胞死亡方式并不是孤立的，相互之间存在一定的转换调节机制。不同的细胞死亡方式在细胞生化代谢、形态学改变等方面有着显著不同，但在功能上有着一定的联系。近年来研究发现，自噬可通过内在的分子调控机制与凋亡相互协调转化，从而调控细胞的生存和死亡。某些情况下，自噬抑制凋亡，促进细胞存活，但自噬本身也会诱导细胞死亡，或与凋亡共同作用，协同促进细胞死亡。Bcl-2蛋白家族、胱天蛋白酶、Atg、P53等是细胞自噬与凋亡交互作用的重要调节因子。此外，受体相互作用蛋白3（receptor-interacting protein 3，RiP3）是凋亡和坏死转换的分子开关。RiP3低水平表达细胞死亡方式选择凋亡，高水平表达则引导细胞走向坏死。现有研究表明，纳米材料作用剂量不同可诱导不同的细胞死亡方式，常表现为纳米材料低浓度作用后，细胞发生自噬或凋亡；而在较高或高浓度作用下，细胞发生坏死。例如，纳米银颗粒诱导细胞发生凋亡所需浓度远低于诱导细胞产生坏死所需浓度［56］；TiO2纳米颗粒30 mg·L-1诱导小鼠L929成纤维细胞发生凋亡，而TiO2纳米颗粒600 mg·L-1可直接诱导细胞发生坏死［57］；富勒烯C60高剂量暴露可引起脑胶质瘤细胞U251发生ROS介导的坏死性细胞损伤，这与氧化应激诱导细胞外信号调节激酶ERK活化有关，而低剂量下则引发ROS非依赖的自噬性细胞死亡［58］。

5　展望

近年来，纳米材料生物毒性数据已有一定的积累，纳米材料引发细胞死亡及其毒作用机制有了一定的认识，但仍存在一些不足。一方面研究主要集中于体外培养的细胞系，而在体内正常组织及细胞中的研究还远远不够；另一方面，实验所用纳米材料的理化性能（材料组成、尺度、形貌和表面性质等）、实验设计和实验条件等的不同，使得纳米材料诱导细胞死亡方面的实验结果不全一致，甚至存在矛盾报道。纳米材料诱导细胞死亡受多种因素的影响。无论通过哪种方式诱导细胞死亡，都受纳米材料本身、其粒径大小和表面化学性质等的影响。对纳米材料进行表面修饰可影响细胞死亡的发生及发生方式。因此，为规范纳米材料生物毒性研究，今后纳米毒理学研究需建立一套相对完整、科学的纳米材料毒性测试的标准方法。此外，当前毒理学研究主要关注纳米材料高剂量毒性效应，但为更切实地贴近纳米材料实际暴露情况，纳米材料的长期低剂量暴露及其毒性效应，如遗传毒性和致癌性等更值得关注。

目前纳米材料诱导细胞死亡的确切分子机制尚未完全阐明。纳米材料诱导细胞死亡的机制现多见于氧化应激、线粒体介导细胞凋亡通路的激活、细胞膜通透性的改变以及DNA的断裂，使得某些细胞最初产生大量自噬体以免除这种毒性损伤或最终导致自噬性死亡、凋亡，重者可致坏死。随着研究的不断深入和研究成果的不断积累，新的毒性损伤机制逐渐被探索出来，但是ERS、代谢或信号转导相关蛋白的功能或结构上的改变机制等方面的研究成果相对较少，有待进一步研究发现其中潜在的价值，以及尚未发掘的机制。此外，除了文中所阐述的自噬、凋亡和坏死外，细胞还存在别的死亡方式，如胀亡、有丝分裂灾变死亡和衰老等，而它们在纳米材料毒性效应中的作用及其分子机制尚不明确，以及不同死亡方式之间的联系还不清楚。

纳米材料诱导细胞死亡效应具有两面性，一方面可能会引发应用于人体的生物安全问题，提示应加强纳米材料的安全性评价，另一方面合理应用其促进靶细胞死亡的作用，将为疾病治疗提供新希望，为纳米材料提供更为广阔的应用前景。虽然在纳米毒理学研究中还有很多未知问题，但纳米材料在疾病诊治方面的应用给医药卫生事业的发展带来了新选择。今后应全面深入研究纳米材料诱导细胞死亡的分子机制以及不同死亡方式之间的交互作用机制，从而在分子水平有效地调控纳米材料引发的细胞死亡效应，为人类疾病的认知和治疗带来新突破。

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（本文编辑：贺云霞）

Cell death induced by nanomaterials：research progress

JIA Jian，LI Yan-bo，GUO Cai-xia
（School of Public Health，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

With the wide use of nanomaterials in biomedicine，materials，chemicals and other fields，their environmental exposure and cellular toxicity have come to the attention of researchers as a new research area in the field of nanotoxicology and nanomedicine.Researches on the toxic effects of nanomaterials have not only provided of a theoretical basis for safety evaluation of nanomaterials，but also promoted the have applications of nanotechnology.Numerous studies have revealed cell death is closely associated with the toxicity of nanomaterials.In this paper，we elaborated on the roles of three key cell death modes in nanotoxicity，including autophagy，apoptosis，and necrosis.Furthermore，the pos⁃sible mechanisms involved in these three modes were explored.All this will provide reference for safety evaluation of nanomaterials.

nanomaterial；cell death；apoptosis；autophagy；necrosis

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81102095）；National Natural Science Foundation of China（81202242）；National Natural Science Foundation of China（81573176）；Science and Technology Development Program of the Beijing Municipal Commission of Education（KM201510025005）；and Project for Young Talents in Beijing Colleges and Universities（YETP1670）

GUO Cai-xia，E-mail：guocx@ccmu.edu.cn，Tel：（010）83911774

R994.6

A

1000-3002-（2016）04-0421-08

国家自然科学基金青年项目（81102095），国家自然科学基金青年项目（81202242），国家自然科学基金青年项目（81573176）；北京市教育委员会科技发展计划面上项目（KM201510025005）；北京高等学校青年英才计划项目（YETP1670）

贾 健，男，首都医科大学2012级七年制临床医学学生。

郭彩霞，E-mail：guocx@ccmu.edu.cn，Tel：（010）83911774

2015-06-17接受日期：2016-02-23）