蛋白质组学技术在药物性肝损伤生物标志物研究中的应用

耿 娅，邓中平（上海中医药大学药物安全评价研究中心，上海 201203）

蛋白质组学技术在药物性肝损伤生物标志物研究中的应用

耿 娅，邓中平
（上海中医药大学药物安全评价研究中心，上海 201203）

临床前药物性肝损伤的评价存在灵敏性低和特异性差的问题，常产生假阴性结果和出现意外的毒性，是导致药物终止开发甚至退市的重要原因之一。在药物肝毒性临床前研究中，可以利用蛋白质组学技术的快速、灵敏、高通量等优点，寻找和发现新的肝毒性生物标志物，使药物开发过程更为安全有效。本文对肝毒性生物标志物的研究现状，蛋白质组学在生物标志物的发现及验证等方面的技术发展进行了综述分析，并且着重归纳了该技术在中药致肝损伤方面的生物标志物研究中的应用。与传统评价方法相比，蛋白质组学技术对于发现新型肝潜在毒性生物标志物具有不可替代的优势。随着蛋白质组学技术结合其他组学技术的发展，其在药物肝毒性早期筛选、生物标志物的临床桥接等方面将取得突破性的进展。

药物性肝损伤；肝毒性；生物标志物；蛋白质组学

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.04.013

在药物不良反应中，药物性肝损伤（druginduced liver injury，DILI）约占9.5%［1］，很多临床使用多年的中草药所致的肝损伤病例报道也在逐年上升［2］。在DILI的临床前评价中，由于目前常用的肝损伤评价指标灵敏度不高及特异性差，常造成假阴性结果［3-4］，很多DILI是在临床试验或药物上市后的临床应用中才监测到，对公众健康造成了严重危害，导致药物的终止开发甚至退市［5］。

传统肝毒性研究主要采用体内与体外评价体系，在敏感性和特异性方面存在很多局限。近年来，靶向、定量质谱技术为检测反映肝损伤新的生物标志物提供了重要平台。自2004年Wetmore和Merrick［6］首次将蛋白质组学技术应用到毒理学研究以来，基于质谱的蛋白质组学技术越来越广泛应用到毒理学研究的各个领域，其中包括毒性生物标志物的研究。本文从DILI生物标志物的研究现状，蛋白质组学技术在DILI蛋白标志物的应用进展等方面进行综述。

1　肝毒性生物标志物

理想的肝毒性生物标志物应有如下特点：肝特异性；其与病理变化的高度相关性；伴随血清谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）和（或）谷草转氨酶（glutamic-oxaloaletic transami⁃nase，GOT）变化的同时，能够提供更多的肝毒性信息；适用于高通量筛选，具有便于检测的商品化检测平台；便于采集样本；不同种属之间均发生变化，便于临床前和临床研究的桥接［7］。但是，现有肝毒性生物标志物尚未能完全达到此标准。

1.1传统肝毒性生物标志物

传统的肝毒性生物标志物的检测主要包括以下3方面：①与肝功能密切相关的指标血清总胆红素（serum total bilirubin，TBil）、血清白蛋白和凝血酶原时间等；②肝细胞毒性的生物标志物GPT、GOT、山梨醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和谷胱甘肽S转移酶等；③评价肝胆管损伤的生物标志物碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ谷氨酰胺转移酶和5′-核苷酸酶等［8］。

目前在临床上尚无法做到仅仅通过监测某个生物标志物而对DILI做出判断，通常为以上指标联用以判定DILI的发生。如国际临床病理检测联合协调委员会建议应测试至少包括GPT、GOT、山梨醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和总胆汁酸5个指标中的2个，以及ALP、γ谷氨酰胺转移酶、5′-核苷酸酶、TBil及总胆汁酸中的2个［9］。而在美国FDA发布的药物肝毒性评价指导原则中提到的“海氏法则”指出，GPT或GOT与TBil的联合升高提示可能有严重肝损伤的发生［10］。这些生物标志物在实际临床应用中已使用多年，由于肝毒性领域的发展突飞猛进，这些传统的标志物受限于特异性、灵敏度等方面的不足，已经不能满足现代药物安全评价的需求，因此亟需发现新的肝毒性生物标志物。

1.2新型肝毒性生物标志物

近年来，利用组学技术和芯片技术等手段为肝毒性研究带来了更多的潜在生物标志物。Murayama等［11］在动物实验中发现，Ⅰ型精氨酸酶以及线粒体鸟氨酸氨甲酰转移酶早于GPT和GOT的变化出现峰值；Miller等［12］发现，细胞色素c在对乙酰氨基酚及D-半乳糖胺给药的大鼠实验中，伴随GPT及GOT的变化也达到峰值，是潜在的线粒体毒性的生物标志物；Coles等［13］发现，谷胱甘酞-S-转移酶α及π异构体［14］主要位于肝小叶中心细胞，因此对肝代谢区的损伤更加敏感，可作为肝损伤恢复评价的生物标志物。此外还有一些新的反映肝损伤的生物标志物，如：嘌呤核苷酸磷酸酶、对氧磷酸、激肽原、苹果酸脱氢酶、血清F蛋白、微小RNA及一些炎症细胞因子等，但是其中大多数仍处于零星的研究阶段，尚未得到广泛验证，有待在临床前及临床试验中证实。另外，针对这些新的标志物的检测手段也有待完善。

2　蛋白质组学技术在DlLl生物标志物研究中的应用

蛋白质组学定量技术通过检测正常与疾病状态下表达差异的蛋白质而成为发现生物标志物的重要途径。虽然蛋白质组学技术可以成功地确定候选生物标志物，但是为确保这些蛋白质在特定生理条件下的特异性，验证是必要的。验证包含2方面的内容，一是评估其准确性、特异性和范围等，二是被验证的标志物与临床特征和结果的相关性。传统的验证方法通常应用基于免疫学技术的方法，如：免疫印迹法、酶联免疫吸附试验或免疫组织化学技术验证靶蛋白，目前这些方法已被广泛应用。但是，当需要验证多个标志物或样本时传统方法费时且价格昂贵，而且并不是所有潜在的生物标志物都有合适的抗体。因此，目前质谱多反应监测技术（multiple reaction monitoring，MRM）或选择性反应监测技术（selective reaction monitoring，SRM）被越来越多的应用于生物标志物的验证。MRM技术可以同时对多个蛋白进行检测且不需要制备抗体，在生物标志物的确认和验证阶段都有极其重要的应用［15-17］。Sakamoto等［18］研究证实了通过MRM技术检测肝细胞色素P-450酶和UDP-葡糖醛酸基转移酶的可靠性。

2.1体外研究

大鼠是最常用的制备原代肝细胞的啮齿类动物。体内毒性研究大部分是在大鼠中进行的，因此对大鼠体内蛋白表达的测定可直接和大鼠体外原代肝细胞的蛋白质组数据相结合。毒理蛋白质组学研究表明，放线菌酮可使丝氨酸苏氨酸蛋白激酶Akt（也被称做蛋白激酶B）失活，以及抑制增强子结合蛋白同源蛋白的合成，从而诱发增强子结合蛋白同源蛋白介导的肝细胞凋亡［19］。Kikkawa等［20］比较了利用大鼠原代肝细胞和大鼠体内实验进行的肝毒性研究，体内的蛋白质组学分析发现氧化应激及线粒体能量代谢调节相关的几个蛋白的变化，这和之前在大鼠原代肝细胞模型上检测到的氧化应激相关蛋白的改变相一致，而氧化应激相关蛋白的改变发生在化合物特异性的组织病理学变化之前。因此，氧化应激蛋白被认为是可能的生物标志物。Chevalier等［21］对比大鼠原代肝细胞在过氧化物酶增殖因子萘酚平（nafenopin）和表皮生长因子作用下蛋白表达变化模式的不同，找出了毒蕈碱类乙酰胆碱受体3，中间丝波形蛋白和ATP合成酶β亚基等32种萘酚平诱导的蛋白，用于进一步阐明过氧化物酶体增殖因子的致癌机制，并为非遗传毒性致癌物的早期确定提供了毒理学标志。这些研究结果同时也表明，利用大鼠原代肝细胞进行的蛋白质组学研究可以有助于早期肝毒性的检测。

HepG2细胞分泌大量的血浆蛋白，如白蛋白、血清转铁蛋白、载脂蛋白和纤维蛋白原等，具有特异性的肝细胞功能［22］。Thome-Kromer等［23］通过对6种肝毒性和4种非毒性药物的体内外蛋白质组学比较，发现虽然在体的种属特异性和肝代谢动力学过程不能被HepG2完全取代，在体大鼠肝中检测到的13个潜在毒性标志蛋白，其中的8个在HepG2中也能检测到，因此认为肝癌细胞系仍保留了肝的部分特异性功能，可作为一个有价值的潜在毒性筛选模型。但是，需要注意的是在HepG2中某些特异性功能，如细胞色素P-450酶的活性可能缺失［24］。因此，可能不适用于需要肝进行生物转化产生毒性的外源性化合物的研究。

肝的主要功能之一是合成血清蛋白，细胞和组织的分泌产物反映了不同的病理生理状态，并且易于在细胞培养基中进行检测，因此也可作为潜在生物标志物的来源。Lewis等［25］研究了乙醇对HepG2/C3A细胞分泌蛋白质的影响，所有的差异蛋白的表达与已知的乙醇体内暴露结果相关联，包括细胞凋亡及炎症改变，说明该模型可用于识别潜在的毒性标志物。Gao等［26］利用细胞色素P-450 酶3A4过表达的人永生化肝细胞基质模型，研究了4种肝毒性化合物和4种非肝毒性物质，将这8种物质分别与细胞共培养20 h后，用液质联用串联质谱法检测培养基发现，肝毒性化合物有2种蛋白BMSPTX-265和BMS-PTX-837的分泌明显增加。随后对20种化合物进行检测发现，这20种化合物BMSPTX-265的梯度和已知的安全性资料完全相关；而BMS-PTX-837则正确预测了20种化合物的19种（其中1例为假阴性）。这项研究表明，蛋白质组学特别是分泌蛋白质组分析可揭示潜在的肝毒性生物标志物。

迄今，尚未见利用蛋白质组学技术在人干细胞来源的肝细胞上进行药物毒性研究［27］。一方面是由于诱导性多能干细胞在从来源细胞诱导成干细胞后，仍保留了部分来源细胞的表达特征；另一方面，将诱导性多能干细胞诱导成肝细胞的分化过程也很难完全重现肝细胞的表达谱，从而使该来源的肝细胞在毒理学研究方面有一定的局限性。但是，上述缺点如可以通过技术进步得到改善甚至解决，那么人干细胞来源的肝细胞在个体化毒性测试方面会是很好的来源，使得针对个体的个性化研究成为可能。

2.2体内实验

在外源性化合物的肝毒性研究中，体内实验通常为28 d或90 d重复剂量毒性实验，甚至长达6～9个月。而蛋白质组学技术和传统的毒性检测技术相比，可能在更早的时间点或更低的剂量发现潜在的毒性作用。Fountoulakis等［28］用蛋白质组学技术对对乙酰氨基酚处理后的小鼠肝组织进行检测，发现35个蛋白表达发生变化，其中一些蛋白是对乙氨基酚的毒性代谢产物N-乙酰对苯醌亚胺的共价修饰靶蛋白，这提示了蛋白质组学技术可鉴定毒性化合物的体内靶蛋白。Koen等［29］进行了进一步研究。他们用14C-溴苯标记的化合物喂饲小鼠，应用双向凝胶电泳（2-dimensional gel electrophore⁃sis，2-DE）技术分离肝蛋白，经标记的目标蛋白可在凝胶上显影。共检测到33个溴苯标记的蛋白质，包括谷胱甘肽S-转移酶、蛋白二硫键异构酶和肝型脂肪酸结合蛋白等。此外，蛋白质组学技术还被用于对乙酰氨基酚、洛伐他丁、SKF-106689和脂多糖及双氯芬酸钠共注射等对肝影响的研究［30-33］。

由于不同报道中，所使用的模型、药物以及针对的肝毒性类别的差异，在这些研究中需要将不同的药物以及蛋白质谱改变与所观察到的肝毒性特征关联起来。如Newsholme等［34］对Sprague-Dawley大鼠给予某嘧啶衍生物后，发现该药物对大鼠肝毒性作用包括肝质量显著增加，弥散性嗜碱性粒细胞增多以及粗糙型内质网和线粒体增加。利用2-DE及质谱技术检测差异表达蛋白，从中发现12个上调蛋白和5个显著下调蛋白，包括蛋氨酸及ATP代谢途径中的蛋氨酸腺苷转移酶和胆固醇合成途径中的线粒体HMG-CoA合成酶，从而揭示了这些蛋白的调节可能和上述观察到的肝毒性有关。Yamamoto等［35］通过研究给药后大鼠肝组织的蛋白表达谱，发现热休克蛋白60、CA3和AK4等蛋白在4种肝毒性药物（对乙酰氨基酚、胺碘酮、四环素和四氯化碳）介导的肝损伤中均发生改变，且变化与血液生化指标及组织病理等传统的毒性终点有关，说明蛋白质组学分析可比较准确地反映甚至预测药物对肝的毒性。

鉴于不同组学技术在灵敏度及特异性等方面的互补性，Eun等［36］利用转录组学和蛋白质组学来检测5种已知会引起DILI的药物〔吡嗪酰胺（pyra⁃zinamide，雷尼替丁（ranitidine），依那普利（enala⁃pril），氯丙嗪（carbamazepine，chlorpromazine）〕，对大鼠转录组和蛋白质谱的影响，通过两者之间的比较，得到60种在2种方法中有一致表现的分子，这也将有助于新的DILI生物标志物的发现。

上述研究主要基于体内的整体蛋白质表达，对细胞内低丰度蛋白或疏水性蛋白如膜蛋白等，可以先对亚细胞器如线粒体、内质网和微粒或细胞膜等的蛋白质组进行分离富集，从而避免了某些低丰度蛋白在全细胞蛋白裂解液中可能检测不到的缺点［37］，并且针对某亚细胞器的蛋白质组学研究可以更加精确地了解该亚细胞结构的功能。Zgoda等［38］对苯巴比妥及3-甲基胆蒽（3-methylcholantrene）诱导所致肝毒性的小鼠进行了细胞质及微粒体亚细胞水平的蛋白质组学分析，从而发现这2种药物对细胞质及微粒体亚细胞水平上的蛋白质谱有不同的作用。Venkatraman等［39］利用2-DE和蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究了大鼠乙醇性肝损伤的肝线粒体蛋白质组，对43个差异表达蛋白进行鉴定，包括涉及到能量代谢的β-氧化循环酶、氧化磷酸化系统的核编码亚基、线粒体蛋白和氨基酸代谢。卢德赵等［40］也利用凝胶内差异显示电泳技术，研究激素诱导的肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组，发现肾阳虚动物热休克蛋白60和热休克蛋白70、肌氨酸脱氢酶、氨甲酰磷酸合成酶、亚硫酸盐氧化酶、ATP合酶、醛脱氢酶和NADH脱氢酶表达增加，而丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、脂酰辅酶A脱氢酶和鸟氨酸氨基转移酶表达降低。这些指标可能成为研究激素诱导的肝毒性的潜在标志物。Lee等［41］也利用基于质谱的蛋白质组学技术，发现在给予小鼠曲格列酮后，线粒体内谷胱甘肽等蛋白的变化介导了曲格列酮的肝毒性。

由于肝合成大多数循环血浆蛋白，在肝细胞受损时血浆中的这类蛋白也会发生变化。因此，平行研究血浆与组织是研究肝毒性的有力手段。Wang等［42］利用2-DE和基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱技术对经Z24（抗血管生成化合物，抑制肿瘤生长和转移）处理过和未经处理的大鼠肝蛋白的差异表达和血浆蛋白的差异表达进行了平行研究。结果发现，给药5 d后在血浆中检测到的Z24肝毒性潜在的生物标志物，可能为胎球蛋白B和精氨琥珀酸合成酶。Merrick等［43］在对乙酰氨基酚暴露后24 h的大鼠血清中也发现了这2种差异表达蛋白。Meneses-Lorente等［44-45］也利用2-DE和质谱技术探究血浆中与脂肪变性相关的蛋白组成在给予某化合物前后的变化，发现在5 d的给药时间内，某些标志物的变化早在给药后6 h即出现，早于传统生物标志物的变化。这些新发现的标志物，包括乙酰辅酶A生产途径中的丙酮酸脱氢酶、苯丙氨酸羟化酶、2-氧代异戊酸脱氢酶以及三羧酸循环中的亚硫酸盐氧化酶。另外，分子伴侣类似蛋白以及受葡萄糖调节的蛋白78的下调也与血浆对氧磷酶、白蛋白和过氧化物氧还酶peroxiredoxinⅣ等分泌蛋白的表达降低相符合。这些特征均可以用作潜在肝脂肪变性相关的生物标志物的筛选。除了用肝匀浆以及血清作为蛋白质组学研究DILI的来源，也有利用尿液蛋白作为研究DILI的来源［46-47］。

相较于体外实验，体内实验更能反映整个机体的变化，更接近实际情况。由于体内系统是一个复杂的模型，药物对肝的作用机制可能受到给药途径及其他器官等各种因素的制约，从而使得体内实验所发现的肝毒性生物标志物可能与体外实验的发现有所不同。如Macdonald等通过比较野生型和过氧化物酶体增殖因子激活受体无效小鼠在过氧化物酶体增殖因子作用下的蛋白表达，找出18种差异蛋白，包括有抗凋亡作用的葡萄糖调控蛋白94的组成性过表达［48］。两种系统各有优劣，如体内实验保留了复杂体内系统内部的相互作用，而体外实验则可利用人来源的细胞。

2.3蛋白质组学在中药肝毒性生物标志物中的应用

中草药是我国的传统治疗药物，而40.3%的DILI为中草药所致。因此，对中药肝毒性的研究是正确使用中药的基础，也是中药国际化的必由之路。利用蛋白质组学技术研究中药对于各种疾病的影响已经有诸多报道［49-50］，但是迄今利用蛋白质组学技术的研究主要集中在药物处理后血浆蛋白图谱的变化，关于中药肝毒性的研究报道较少。Goto等［51］对大鼠给予3%桂枝茯苓丸或3%当归芍药散后，质谱研究发现有3个质谱峰在2种药物处理后均有所增加。对血虚症小鼠给予四物汤后，利用蛋白质组学技术也发现血清中有12个蛋白下调，4个蛋白（肌细胞增强蛋白，马达蛋白，肌动蛋白结合蛋白和DNA依赖的蛋白激酶）上调［52］。扶正化瘀方灌胃治疗大鼠肝纤维化，取肝组织进行蛋白质谱研究，从而发现30个差异表达蛋白，包括多种与代谢相关的蛋白［53］。另外，还有血府逐瘀汤治疗气滞血瘀证模型大鼠后血清蛋白质的变化的报道［54］。

3　结语

蛋白质组学技术的应用在肝毒性化合物的分类中取得了令人兴奋的成果，并根据这些分类揭示了潜在的蛋白质生物标志物［55］。体外细胞模型在毒理学研究中已证明有很好的前瞻性，这些肝细胞模型的分泌蛋白质组中包含了丰富的潜在生物标志物，在培养基中易于测量，因此与临床检测具有良好的桥接性。利用蛋白质组学技术寻找肝毒性生物标志物的过程中，也可结合在不同样本之间发现的潜在标志物。如肝组织或尿液中发现的潜在标志物，可借鉴用于研究其在血浆中的变化；并且由于DILI可能表现在各个不同组织器官中，在多个组织中的研究也将有助于更加了解DILI损伤机制。在初步确立某些潜在标志物后，需要在临床及肝毒性相关的转化医学中进一步探索其可用性，从而使该标志物具有更好的预测和诊断功能。同时，值得注意的是，单一蛋白质生物标志物的测定可能存在假阳性，因此可在获得典型肝毒性药物诱导的差异蛋白后，将这些生物标志物进行组合，并以此区分化合物特异性的毒性机制。另外，基于质谱的蛋白质组学技术在某些物质的检测方面可能存在如下技术难点：①需要更高效的分离技术，有效的质谱碎裂，快速准确的质谱鉴定法。如基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱检测到的肽段较少，不利于搜库，无法进行混合蛋白质鉴定等；非标记定量技术分析复杂样品的能力有限，而标记法则费用昂贵，周期较长等；②在细胞信号传导中起重要作用但丰度相对较低的磷酸化蛋白，需要通过富集再利用高分辨率质谱进行检测，而很多有潜力成为肝损伤生物标志物的小分子代谢物质，较难利用蛋白质组学技术进行检测，也需要依靠其他检测手段进行补充。在迄今为止的研究中，除了某些蛋白质的变化比较稳定可以成为潜在的肝毒性生物标志物，很多蛋白质的变化只是在零星的文献中得到报道，重复性比较差。这些物质要作为新型生物标志物，需要更具特异性和灵敏度的蛋白质组学技术以及更大的样本量去验证。随着组学技术的发展和数据库的整合，蛋白质学组数据也可以和其他组学数据互补，如在基因表达谱与蛋白质表达谱之间进行比较互相验证，从而获得更加可靠的生物标志物，在DILI早期评价和临床桥接等方面取得突破性的进展［56］。

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（本文编辑：沈海南）

Application of proteomics to screening biomarkers of drug-induced liver injury

GENG Ya，DENG Zhong-ping
（Center for Drug Safety Evaluation and Research，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

The preclinical safety assessment of hepatotoxicity drugs has a low sensitivity and low specificity.Related tests often generate false negative results and unexpected toxicity，which is one of the major reasons for the cessation of development and withdrawal from the market.Proteomics enjoys advantages of rapidness，high sensitivity and high throughout，and therefore can be used in the search for new biomarkers of hepatotoxicity in preclinical studies，leading to the development of safer drugs and a more efficient drug discovery process.In this review，the current preclinical biomark⁃ers of liver toxicity and development of proteomic technologies in the discovery and validation of bio⁃markers of drug-induced liver injury are described，in general the application of proteomics to Chinese medicine-induced liver toxicity in particular.Compared with traditional methods，proteomic technologies show promising results for the discovery of novel hepatotoxic markers.Proteomics，in conjugation with other omics techniques，will play a major role in the early stage of hepatotoxicity screening and will prove to be a good bridge in clinics in the future.

drug-induced liver injury；hepatotoxicity；biomarkers；proteomics

Foundation ltem：The project supported by National Science and Technology Major Project（2012ZX09505001-002）

DENG Zhong-ping，E-mail：dzp@shutcm.edu.cn，Tel：（021）51322401

R966，R575

A

1000-3002-（2016）04-0381-08

国家科技重大专项（2012ZX09505001-002）

耿 娅，女，博士研究生，主要从事中药肝毒性研究。

邓中平，E-mail：dzp@shutcm.edu.cn，Tel：（021）51322401

2015-12-22接受日期：2016-02-23）