REP、RAPD和PFGE方法在志贺菌分子分型中的应用评价

李 琦 姜大栋

（辽宁省大连市中山区疾病预防控制中心，辽宁 大连 116013）

REP、RAPD和PFGE方法在志贺菌分子分型中的应用评价

李 琦 姜大栋

（辽宁省大连市中山区疾病预防控制中心，辽宁 大连 116013）

目的探讨REP、RAPD和PFGE方法在志贺菌分子分型中的应用效果。方法 以细菌基因组重复序列（REP）、随机扩增多态性分析（RAPD）、脉冲场凝胶电泳（PFGE），分别对60株志贺菌分子进行分型，并对3种方法加以评估。结果 REP、RAPD和PFGE的分子分型结果显示，采用REP方法，有A、B两型；采用RAPD方法，有A、B、C、D、E、F六型；采用PFGE方法，共有3个亚型，其中，51株可分为A、B、C、D、E五型，其余6株宋内志贺菌为1单独型。结论 在3种分子分型方法中，REP对高菌株分辨率差，在区域内菌株分型方面，不具优势；RAPD分辨率高、分型精准，但需花费较长时间；PFGE明显优于前二者，分型效果更为细致，三者之间的差异性显著，但PFGE操作更简便，用时更少，价格更低，而且对于细菌性痢疾暴发事件，有较好的病学调查效果。

REP；RAPD；PFGE；志贺菌分子；分型

伴随分子生物学的发展，出现了便于操作、分辨率高、易于推广的分型技术；在病原菌分子分型方面，有许多方法，但目前还未形成集诸多优点于一体的综合性方法。当前的PFGE分型技术属于该领域的“金标准”，与REP、RAPD相比，优势更为明显[1]。本组研究中，以细菌基因组重复序列（REP）、随机扩增多态性分析（RAPD）、脉冲场凝胶电泳（PFGE），分别对60株志贺菌分子进行分型，并对3种方法加以评估。现将具体情况报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：以REP、RAPD、PFGE，分别对60株志贺菌分子进行分型。首先，准备好仪器与试剂；本组实验中，选择GeneLight 2004型PCR扩增仪、JY300C型电泳仪、JY02S型紫外分析仪、脉冲场凝胶电泳仪，选择PFGE图像分析软件；系统有凝胶成像系统；本组实验中，选择的试剂有琼脂糖、TAE缓冲液、溴化乙锭、蛋白酶K、TaKaRa Tap kit、Marker DL2000、XbaI、Not Ⅰ限制性内切酶、Seakem Gold低熔点琼脂糖；选择中国疾病预防控制中心传染病的标准Marker H9812。

1.2 方法：首先，对DNA提取；对志贺菌单个菌进行分离，并将其落传种于M-H平板；其次，孵箱培养，温度控制在35 ℃，以16 h为培养期；第三，对三环四环菌株进行双蒸水混合（100 µL），需将温度控制在95 ℃，一般煮5 min即可，室温离心以每分钟12000转为宜，30 s时间即可；DAN的提取，选择上清即可；第四，运用REP、RAPD、PFGE 3种方法进行具体检测。

1.3 统计学方法：应用SPSS19.0软件操作系统进行数据统计，计量资料用（）表示，计数资料用χ2检验，组间均数比较采用t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结 果

REP、RAPD和PFGE的分子分型结果显示，采用REP方法，有A、B两型；采用RAPD方法，有A、B、C、D、E、F六型；采用PFGE方法，共有3个亚型，其中，51株可分A、B、C、D、E五型，其余6株宋内志贺菌为1单独型。

3 讨 论

本组研究中，采用REP、RAPD、PFGE，分别对60株志贺菌分子进行分型；在REP检测方面，以5’-GCGCCGLCATGCGGCATT-3’为单引物序列设计；在PCR体系中，选择TapDNA聚合酶（5 U/µL）和缓冲液（Mg2+plus，选择5 µL为宜），还有Dntp（4 µL）、25 mmol/L MgCl2（2 µL）、10 µmol引物（5 µL）、模板DNA（5 µL）、无菌双蒸水（需补足，总反应体积为50 µL）、液体石蜡（30 µL）；PCR扩增条件选择94 ℃（3 min）、94 ℃（1 min）、40 ℃（1 min）、65 ℃（2 min，30个循环）、65 ℃（10 min）；琼脂糖凝胶电泳方面，对上面步骤所产生的物质与loading bufer进行混合，先取15 µL，再与10 ×loading bufer物进行均匀混合，再加入含有1%的EB，置于琼脂糖凝胶孔中，此时，需将DNA marker DL 2000同时加入；电压100 V，电泳时间以3 h为宜，注意必须在紫外灯下进行细致观察，并对结果加以记录；此检测中，以肉眼观察，并进行Tenover标准判读，作为判定标准[2]。

在RAPD检测中，以5’-GCGCCGLCATGCGGCATT-3’为单引物序列设计；在PCR体系中，选择TapDNA聚合酶（0.5 µL）、10*缓冲液（Mg2+plus，选择5 µL为宜），还有10 mmol/L Dntp（4 µL）、25 mmol/L MgCl2（5 µL）、10 µmol引物（5 µL）、模板DNA（5 µL）、无菌双蒸水（需补足，总反应体积为50 µL）、液体石蜡（30 µL）；PCR扩增条件选择94 ℃（3 min）、94 ℃（30 s）、30 ℃（30 s）、72 ℃（60 s，30个循环）、65 ℃（5 min）；琼脂糖凝胶电泳方面，对上面步骤所产生的物质与loading buffer进行混合，先取15 µL，再与10×loading buffer物进行均匀混合，再加入含有1%的EB，置于琼脂糖凝胶孔中。此时，需将DNA marker（100 bp Ladder）同时加入；电压100 V，电泳时间以3 h为宜，注意必须在紫外灯下进行细致观察，并对结果加以记录；此检测中，可忽略条带密度，若条带数、位置相同，则归于同一类型；通常的判定标准以条带数目差≥2时，归于异型[3]。

在PFGE检测中，以“金标准”分析法为主，需使用限制性内切酶Not Ⅰ（对福氏志贺菌）；对于宋内志贺菌、标准株H9812，则需选择限制性内切酶Xba Ⅰ，按照指纹图谱分析软件进行分析（BioNumerics software）。结果显示，REP、RAPD和PFGE的分子分型结果显示，采用REP方法，有A、B两型；采用RAPD方法，有A、B、C、D、E、F六型；采用PFGE方法，共有3个亚型，其中，51株可分A、B、C、D、E五型，其余6株宋内志贺菌为1单独型。

综上所述，REP对高菌株分辨率差，在区域内菌株分型方面，不具优势；RAPD分辨率高、分型精准，但需花费较长时间；PFGE明显优于前二者，分型效果更为细致，三者之间的差异性显著，但PFGE操作更简便，用时更少，价格更低，而且，对于细菌性痢疾暴发件，有较好的病学调查效果。

[1] 丁水军.脉冲场凝胶电泳技术及其在病原菌分子分型中的应用[J].中国卫生检验杂志,2012,12(53):110-111.

[2] 李雪,金莉莉,王秋雨.病原微生物分子分型技术研究进展[J].中国公共卫生,2015,11(8):147-148.

[3] 孙永艳,申泉,李艳琴.肠杆菌基因间重复共有序列及应用[J].生命的化学,2014,13(6):10-11.

R378.2+5

B

1671-8194（2016）36-0021-02