柱前衍生/高效液相色谱-荧光检测器测定面粉制品中的偶氮甲酰胺

章建辉，欧阳丽，彭新凯，夏立新，李　欢，汪　辉

(1.长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南　长沙　410013；2.湖南澄源检测有限公司，湖南　长沙　410000)



柱前衍生/高效液相色谱-荧光检测器测定面粉制品中的偶氮甲酰胺

章建辉1,2*，欧阳丽1，彭新凯1，夏立新1，李欢1，汪辉1

(1.长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南长沙410013；2.湖南澄源检测有限公司，湖南长沙410000)

摘要：建立了面粉制品中偶氮甲酰胺(ADA)残留量的丹磺酰氯柱前衍生结合高效液相色谱-荧光检测器的分析方法。面粉制品中的ADA经湿热处理后，转变成氨基脲(SEM)，加入丹磺酰氯(DNS-Cl)进行衍生。采用Aglient TC C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)对衍生产物进行分离，流动相为乙腈-水(65∶35)，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，激发波长330 nm，发射波长530 nm，高效液相色谱-荧光检测器检测，外标法定量。偶氮甲酰胺在0.1～50 mg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数(r)大于0.998，检出限(LOD)和定量下限(LOQ)分别为0.03 mg/L和0.10 mg/L。在0.1，0.3，1.0 mg/kg 3个加标水平下的平均回收率为78.4%～96.6%，相对标准偏差(RSD,n=6)为7.1%～9.4%。该方法具有简便、快速、灵敏等特点，可用于面粉制品中偶氮甲酰胺的检测。

关键词：柱前衍生；高效液相色谱-荧光检测器；偶氮甲酰胺；丹磺酰氯

偶氮甲酰胺(Azodicarbonamide,ADA)又名偶氮二酰胺，为黄至橘红色结晶性粉末,具有漂白和氧化双重作用,是工业中常用的发泡剂。偶氮甲酰胺也作为漂白剂和改良剂在面粉中使用，GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》规定小麦粉中偶氮甲酰胺的最大用量为45 mg/kg[1]。研究表明，偶氮甲酰胺在湿热条件下分解产生联二脲(Biurea,HDC)，联二脲在高温条件下又能转变成氨基脲(Semicarbazide,SEM)[2]，然而氨基脲具有致突变和致癌作用。近年来，大量研究表明，由于偶氮甲酰胺全部降解生成联二脲与氨基脲[3-5]，故在面粉制品中不能检出。因此，有必要建立面粉制品中偶氮甲酰胺的最终代谢产物氨基脲的检测方法，并通过氨基脲的含量来评估面粉中偶氮甲酰胺的使用量。

目前，有关偶氮甲酰胺及其代谢物联二脲和氨基脲的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)[6-7]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等[8-11]，其中HPLC法具有简单、快速等特点，但提取困难、操作繁琐、响应低、干扰多；LC-MS/MS法灵敏度高、专一性强，但仪器价格昂贵；因此开发一种操作简单、灵敏度高的检测方法非常重要。丹磺酰氯作为液相色谱柱前衍生试剂具有衍生操作简单、衍生物稳定性好、荧光吸收强、灵敏度高、反应范围宽、基体干扰不明显等优点[12]，在胺类化合物分析中应用广泛[13-14]，此衍生方法在面粉制品中偶氮甲酰胺的检测方面尚未见报道。本文采用丹磺酰氯与偶氮甲酰胺代谢物氨基脲进行衍生反应，高效液相色谱-荧光检测器进行分离测定，对面粉制品中偶氮甲酰胺代谢物氨基脲进行检测。该方法简单、快速、稳定，可进行实际应用。

1实验部分

1.1仪器与试剂

LC-20AT高效液相色谱仪，配自动进样器和荧光检测器(日本岛津公司)；CT14D型台式高速离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；SK-1型快速混匀器(江苏金坛医疗仪器厂)；A10型超纯水处理器(美国Millipore公司)。

乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；正己烷、碳酸氢钠、氢氧化钠、氯化氢、冰醋酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；偶氮甲酰胺(含量>97.0%，上海沃凯化学试剂有限公司)；丹磺酰氯(含量>98.0%，日本东京化成工业)；实验用水为超纯水。

1.2标准溶液的配制

称取10 mg(精确至0.001 mg)偶氮甲酰胺，用25 mL 0.5 mol/L 盐酸于60 ℃水解4 h，冷却后用 0.5 mol/L氢氧化钠调至中性,加水定容至100 mL配成100 mg/L的标准储备液，于4 ℃冷藏保存；使用时用水逐级稀释成所需浓度的工作液。

1.3样品的提取与净化

精确称取1.0 g样品于15 mL塑料离心管中，加4 mL 0.5 mol/L盐酸涡旋混匀，60 ℃水浴水解4 h,冷却后用0.5 mol/L氢氧化钠调至近中性，分别加入1 mL亚铁氰化钾和乙酸锌溶液，定容至10 mL后加1 mL正己烷涡旋混匀。5 000 r/min离心5 min，弃去正己烷层，取1 mL上清液衍生。

1.4样品衍生

取1 mL待衍生液置于15 mL塑料离心管中，加入1 mL 0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲溶液(pH 9.5)与1 mL 3.0 mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液，涡旋混匀，避光下50 ℃水浴衍生45 min。5 000 r/min离心3 min，将上清液过0.45 μm有机相滤膜后上液相色谱-荧光检测器检测。

1.5色谱条件

色谱柱：Agilent TC C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；流动相：水-乙腈溶液(35∶65)，进样量10 μL；激发波长330 nm，发射波长530 nm。

2结果与讨论

2.1样品的提取与净化

面粉制品中添加的偶氮甲酰胺经过高温、高湿环境后，将分解为联二脲和氨基脲，采用纯水提取时，只能得到基质中的氨基脲[3]。本实验参考文献方法[9，11]，采用4 mL 0.5 mol/L盐酸于60 ℃水浴4 h对样品进行水解，该条件下面粉制品中的偶氮甲酰胺和联二脲全部转化为氨基脲。为保证检测灵敏度和检测结果的可靠性，需去除水解后面粉制品中含有的脂肪和蛋白成分。面粉制品经盐酸水解后，以0.5 mol/L氢氧化钠调节溶液至中性，再加入亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白；然后加入正己烷脱脂，5 000 r/min离心5 min后弃去正己烷层。

2.2流动相的选择

根据相关文献研究[15]，考察了乙腈-水和乙腈-0.01 mol/L乙酸钠(乙酸调至pH 4.2)分别作为流动相时衍生产物与杂质峰色谱分离的情况。结果显示，提高流动相中乙腈的比例可以加快分离过程，但乙腈比例过高时，目标峰与杂质峰无法基线分离，干扰检测。当流动相中乙腈和水的体积比为65∶35时，目标峰与杂质峰的分离度为1.8，保留时间为8.354 min，分析时间较短。当流动相中乙腈和0.01 mol/L乙酸钠的体积比为65∶35时，目标峰与杂质峰也能得到良好分离，但保留时间变长(10.50 min)。此外，乙腈-0.01 mol/L乙酸钠流动相的配制繁琐，因此本实验采用乙腈-水(65∶35)作为流动相。

图1　pH值对偶氮甲酰胺峰面积的影响Fig.1　Effect of reaction pH value on peak area of ADA(50 mg/L)

图2　衍生反应温度和时间对偶氮甲酰胺峰面积的影响Fig.2　Effect of derivative reaction temperature and time on peak area of ADA(50 mg/L)

2.3衍生条件的优化

2.3.1衍生溶剂的pH值反应介质的pH值对氨基脲衍生反应的影响很大。实验考察了0.1 mol/L 碳酸氢钠缓冲溶液的pH值分别为8.5，9.0，9.2，9.5，10.0，10.5，11.0时衍生产物的峰面积，结果见图1。由图可知：随着pH值的逐渐增大，衍生产物丹磺酰-氨基脲产量先增加后减小，在pH值为9.5时，衍生物的生成量最大。因此实验选取pH 9.5的 0.1 mol/L 碳酸氢钠缓冲溶液作为反应介质。

2.3.2衍生溶剂的浓度根据衍生反应的比例关系及衍生剂需适当过量的原则，在系列15 mL离心管中加入1 mL 50 mg/L标准品后，再加入1 mL浓度为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液进行衍生反应。结果显示：随着丹磺酰氯浓度的增大，其衍生物产量增多，当加入3.0 mg/mL丹磺酰氯时，衍生物产量达到稳定值；但丹磺酰氯的浓度大于3.0 mg/mL时，衍生反应溶液会出现浑浊，产生不溶性的黄色物质。为节约成本，实验选取3.0 mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液为衍生溶剂。

2.3.3衍生反应温度与时间的选择考察了不同温度和时间对衍生物产率的影响(见图2)。结果表明：衍生温度为50 ℃，时间为 45 min时衍生物的生成量最大。对比考察了室温避光过夜衍生和50 ℃衍生 45 min的结果，2种衍生条件下衍生物的生成量未见明显增加。由于温度过高或衍生时间过长时，均会导致衍生副反应过多，而室温避光隔夜的衍生时间过长，因此实验选取50 ℃水浴45 min作为衍生条件。

2.4稳定性考察

取相同浓度的标准溶液和样品加标溶液，分别放置0，5，10，15，24，36 h后进行测定，待测组分峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为3.3%和4.1%，表明衍生物在36 h内稳定性良好。

2.5线性范围、检出限与定量下限

分别吸取一定体积的偶氮甲酰胺标准溶液，配制成质量浓度为0，0.1，0.5，1.0，10.0，20.0，50.0 mg/L的系列偶氮甲酰胺工作液，取1 mL按照“1.4”方法进行衍生，“1.5”方法进行色谱分析。以质量浓度(X，mg/L)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标求得线性回归方程为Y=1 659.8X+3 691.7，相关系数(r)大于0.998。以信噪比S/N≥3及S/N≥10分别确定方法的检出限为0.03 mg/L，定量下限为0.10 mg/L。

2.6回收率与相对标准偏差

选取不含偶氮甲酰胺的面粉制品作为基质，进行0.1，0.3，1.0 mg/kg 3 个浓度水平的加标回收实验，同一加标水平平行测定6次，其平均回收率分别为78.4%，85.7%，96.6%，RSD分别为9.4%，7.1%及7.5%。相关色谱图见图3。

2.7与其他方法的比较

与相关文献方法进行比较，本方法的定量下限(LOQ=0.10 mg/L)介于HPLC(LOQ=1.0 mg/kg)[6]和HPLC-MS/MS(LOQ=0.000 5 mg/kg)[11]两者之间，说明本方法灵敏度高，具有很高的准确性。

2.8实际样品的检测

应用本方法对市购10个不同类型面粉制品进行分析。结果显示，4个样品中检出偶氮甲酰胺，其含量为1.06～18.4 mg/kg，该含量小于国家规定的偶氮甲酰胺在面粉中的最大残留限量。

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Determination of Azodicarbonamide in Flour Products by High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector Coupled with Precolumn DerivatizationZHANG Jian-hui1，2*，OUYANG Li1，PENG Xin-kai1，XIA Li-xin1,LI Huan1,WANG Hui1

(1.Changsha Center of Supervision & Inspection on Food Quality Safety,Changsha410013,China；2.Hunan

Chengyuan Testing Corporation Limited,Changsha410000,China)

Abstract：A method was developed for the determination of azodicarbonamide(ADA) in flour products using dansyl chloride(DNS-Cl) precolumn derivatization combined with high performance liquid chromatography-fluorescence detector.ADA in flour products was hydrolyzed by wet heat processing and formed semicarbazide(SEM) finally.SEM was derivatized with DNS-Cl.The derivatization product was separated on an Aglient TC C18column(250 mm× 4.6 mm,5 μm) using acetonitrile-water(65∶35) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The oven temperature was set at 30 ℃，the excitation wavelength was 330 nm and the detection wavelength was 530 nm.Under the optimal conditions,the linear range for ADA was in the range of 0.1-50 mg/L with correlation coefficient(r) higher than 0.998.The limits of detection(LOD)and limits of quantitation(LOQ) for the method were 0.03 mg/L and 0.10 mg/L,respectively.The spiked recoveries of ADA at three levels of 0.1,0.3,1.0 mg/kg ranged from 78.4%to 96.6%with RSDs of 7.1%-9.4%.With advantages of simplicity,rapidness and sensitivivity,the method was successfully applied in the analysis of ADA in flour products.

Key words：precolumn derivatization；high performance liquid chromatography-fluorescence detector；azodicarbonamide(ADA)；dansyl chloride

中图分类号：O657.72;TQ314.259

文献标识码：A

文章编号：1004-4957(2015)12-1430-04

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.018

通讯作者：*章建辉，硕士，工程师，研究方向：食品与环境分析，Tel:0731-88635360,E-mail:zhangjianhui2012@163.com

基金项目：国家公益性行业科研专项项目(201310130)

收稿日期：2015-05-11；修回日期：2015-06-02