恶性黑色素瘤免疫治疗现状

钱新宇 潘月龙

●综 述

恶性黑色素瘤免疫治疗现状

钱新宇 潘月龙

恶性黑色素瘤是一种具有高度侵袭性的肿瘤类型，早期就容易通过淋巴和血行转移，总体5年生存率低于10%，晚期恶性黑色素瘤5年生存率仅为5%左右，属于最难有效治疗的恶性肿瘤之一。与其恶劣的生物学行为似乎有些相悖的是恶性黑色素瘤往往表现出较好的抗原性和免疫原性[1-2]，例如：黑色素瘤的原发部位常常出现强烈的淋巴细胞浸润，进而导致部分甚至完全的肿瘤缓解；白癜风的出现是黑色素瘤患者预后良好的标志[3]；免疫治疗在恶性黑色素瘤的长期治疗实践中取得了肯定疗效[4-5]。基于这些特性，恶性黑色素瘤被认为是免疫原性肿瘤的最佳代表，同时，免疫治疗也被认为是恶性黑色素瘤治疗的基石。随着易普利单抗（Ipilimumab）和纳武单抗（Nivolumab）等免疫检查点抑制剂药物在临床试验中的巨大成功，恶性黑色素瘤的免疫治疗越来越受人关注，甚至引发了整个肿瘤领域的免疫治疗热潮。本文拟对近年来恶性黑色素瘤免疫治疗的进展进行综述，对指导临床实践提供一定的帮助。

1 细胞因子

目前应用于恶性黑色素瘤临床治疗的细胞因子主要包括IL-2和IFN两类，属于细胞免疫系统分泌的小分子蛋白。IL-2是辅助型T淋巴细胞活化产生的细胞因子，其作用主要表现在刺激自然杀伤细胞和T细胞的增殖和活化，并增强其抗肿瘤活性。大剂量IL-2（HD IL-2）被认为是首个用于黑色素瘤的免疫疗法，美国FDA于1998年批准其用于不可切除的恶性黑色素瘤。所谓HD IL-2疗法是指IL-2 600 000～720 000U/ kg，静脉给药，1次/8h，共14次，予治疗的d1～5给药，休息6～9d开始第2个疗程。文献表明HD IL-2总有效率为12%～21%，其中完全缓解（CR）约为6%，CR患者往往可获得长期缓解，约50%患者持续缓解时间长达5年，提示部分CR的患者具有可治愈性[4]。尽管该方案充分发挥了IL-2的抗肿瘤作用，但也存在严重的不良反应，主要包括严重低血压、肺水肿、因全身水肿导致的体重增加和肾功能不全、缺氧、心律失常、疲劳等[6]。肿瘤免疫治疗学会（SITC）推荐大剂量IL-2为体力状态（performance status，PS）评分好且无中枢神经系统疾病的BRAF野生型的Ⅳ期黑色素瘤的一线治疗[7]。从国内的临床实践来看，极少有恶性黑色素瘤的患者采用HD IL-2疗法。主要是受制于中国人的体质及前面提到的严重的不良反应，特别是严重的毛细血管渗漏综合征，其极度凶险性以及处置要求的相对专业性导致病死率很高，阻碍了HD IL-2疗法的临床应用。另外，越来越多的研究提示，HD IL-2疗法所获得的CR患者长期生存并非其特有的，有可能是免疫治疗共同的特征，再加上新的较低不良反应的免疫治疗药物和方法的问世，HD IL-2疗法在恶性黑色素瘤的治疗上的地位有可能被进一步削弱。黑色素瘤患者的遗传背景会影响到IL-2的疗效，近期文献报道神经母细胞瘤鼠肉瘤病毒（NRAS）突变患者预测IL-2治疗将获得更好的效果[8]。基因分型后选择性地应用IL-2治疗，进一步提高有效率、减少治疗相关性死亡，将是IL-2在黑色素瘤治疗领域摆脱窘境，重新确立地位的可能选择。

IFN具有多种生物学活性。应用于黑色素瘤治疗的主要是IFN-α，特别是IFN-α2b。其主要通过抗增殖、诱导分化，修饰肿瘤细胞抗原、促进机体识别相关抗原和清除肿瘤细胞，以及抗血管生成等作用达到治疗效果。中低剂量的IFN已被证实对恶性黑色素瘤无明确治疗价值，不能提高患者无病生存率、无复发生存率和总生存率。只有大剂量IFN（HDI）治疗可延长黑色素瘤切除术后高危患者的无复发生存时间，提高总生存率。美国国立综合癌症网络（NCCN）指南推荐HDI（2 000 wiu/m2d1～5×4周，1 000wiu/m2tiw×48周）为恶性黑色素瘤高危患者术后辅助治疗方案，中国黑色素瘤诊治指南同时推荐了中国患者治疗经验：1 500wiu/m2d1～5× 4周，900wiu tiw×48周，治疗强度下调，使其具有更好的耐受性，但较国外标准剂量疗效无统计学差异。另外，5年新型长效干扰素α2b（Peg-IFN-α2b）方案也已经被批准用于Ⅲ期恶性黑色素瘤术后辅助治疗，相比HDI更易耐受，疗效无统计学差异。但HDI治疗对晚期恶性黑色素瘤缺乏疗效，不推荐用于进展期黑色素瘤治疗。不仅如此，近期KellyM.McMasters等[9]一项前瞻性随机对照Ⅲ期研究发现仅单个前哨淋巴结（SLN）阳性的患者，无法从HDI辅助治疗中获益，而对于病理及免疫组化阴性但RT-PCR阳性的患者，淋巴结清扫术（CLND）及CLND＋HDI均无法延长总生存期，提示HDI辅助治疗的获益人群可能比较有限，结合HDI较高的不良反应发生率（3级毒性反应67%），指南的推荐存在进一步优化的可能。但是由于Ipilimumab在黑色素瘤辅助治疗上表现出的较高的药物相关性死亡，HDI的地位目前还不可动摇。

2 疫苗

肿瘤疫苗旨在通过激发肿瘤特异性T淋巴结细胞来增强机体免疫系统识别与杀伤肿瘤细胞能力。主要分为肿瘤抗原疫苗和细胞疫苗两大类。该领域最成功的典型非Sipuleucel-T莫属，它是全球第一个被FDA批准的肿瘤疫苗，2010年4月批准用于治疗无症状或症状轻微的转移性去势治疗无效的前列腺癌。Kantoff等[10]在临床研究中，将512例对去势治疗无效的晚期转移性前列腺患者随机分成两组，一组患者接受Sipuleucel-T治疗，另一组接受安慰剂。结果提示：与安慰剂组相比治疗组的死亡风险相对下降了22%（P=0.03），中位总生存期（overall survival，OS）延长了4.1个月（25.8个月vs21.7个月），这一结果极大鼓舞了肿瘤疫苗治疗研究。

但是，疫苗治疗在黑色素瘤治疗领域却没有获得突破性进展。2010年报道了一种针对肿瘤-睾丸、MAGE-A3抗原的蛋白疫苗——特异性肿瘤免疫治疗（ASCI），其在针对不能手术切除的Ⅲ期或Ⅳ期恶性黑色素瘤患者的Ⅱ期临床试验中显示了良好的前景[11]，但在之后的Ⅲ期临床试验中均未能获得阳性结果，无法显著延长黑色瘤患者的无进展生存期，是否能让黑色瘤患者的某个亚群受益尚需期待进一步研究结果。另外一个治疗黑色素瘤的肿瘤疫苗药物Allovectin的Ⅲ期临床研究也因未能达到其预期目标而宣告失败。总的来说，黑色素瘤疫苗治疗尚需时日。

3 溶瘤病毒（Talimogene laherparepvec，T-VEC）

T-VEC在恶性黑色素瘤治疗领域的突破被认为是2015年度肿瘤免疫治疗十大进展之一。T-VEC由1型单纯孢疹病毒（HSV-1）经过程改造而获得的。其作用机制主要通过特异性感染肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内大量复制，导致宿主肿瘤细胞溶解和死亡。与此同时，死亡细胞释放出的大量病毒颗粒产生级联效应，放大溶瘤效果。肿瘤细胞的崩解，释放出肿瘤源性抗原和GM-CSF入血，诱导全身的抗肿瘤免疫反应，增强疫苗的抗肿瘤效果。OPTiM等[12]研究共招募了436例发生远端转移或有不可切除区域的黑色素瘤患者，其中295例患者接受T-VEC治疗，141例患者接受GM-CSF治疗。研究的主要终点是持续缓解率（DRR），即从最初12个月内开始持续时间超过6个月的CR率+部分缓解（PR）率；次要终点包括总生存和总缓解率。临床研究结果显示T-VEC组DRR显著高于GM-CSF组（16.3%vs 2.1%，P＜0.001）。其中，在持续缓解的患者中，29.1%的患者获得持续CR，其余患者获得持续PR。T-Vec组有更高的总缓解率（26.4%vs 5.7%，P＜0.001）。总体上来看，T-VEC组中共有32例（10.8%）患者获得CR，而GM-CSF组中CR患者仅有1例（＜1%）。OS分别为23.3个月和18.9个月（HR=0.79，P=0.051），虽无统计学意义，但已经体现了一定的趋势性特征。2015年10月27日，FDA根据该项研究结果批准了T-VEC（Imlygic）用于首次手术后复发的黑色素瘤患者不可切除的皮肤、皮下和淋巴结病灶的局部治疗。这是首个获得FDA批准的溶瘤病毒类治疗药物。T-VEC最常见的不良反应为寒战、发热以及流感样症状等，但总体不良反应可控。研究者同时指出由于该治疗药物使用的是活的基因修饰的单纯疱疹病毒，存在感染疱疹病毒的风险，因此禁用于孕妇和免疫受损的患者。T-VEC显著的临床疗效为恶性黑色素瘤的免疫治疗开辟了一片全新的天地，期待其与其它药物或治疗手段的联合应用能获得更佳的临床试验结果。

4 过继性细胞免疫治疗（adoptive cell therapy，ACT）

4.1 肿瘤浸润T淋巴细胞 (tumor infiltrating lymphocytes，TIL） TIL是从肿瘤组织分离得到的，经过细胞因子比如IL-2诱导可体外培养并大量扩增的淋巴细胞。目前几乎所有有关TIL治疗的研究都在关注黑色素瘤，其在黑色素瘤的疗效令人瞩目。1986年Rosenberg等[13]在Science发表的研究，开创性使用自体TIL联合环磷酰胺在小鼠模型中可使黑素瘤转移灶消退。1988年Rosenberg等[14]报道了TIL治疗人类转移性黑色素瘤疗效。首先是通过静脉使用环磷酰胺预先清除患者的淋巴细胞，再进行TIL静脉回输，同时联合IL-2，以促进抗肿瘤T细胞存活和扩增。该研究共入组20例转移性黑色素瘤，12例患者达到了PR或CR。2008年该研究团队采用环磷酰胺联合氟达拉滨清除体内的免疫细胞，然后将体外扩增TIL回输，获得了51.4%的缓解率，平均缓解期达11.5个月[15]。2011年该研究团队采用全身照射（total body irradition，TBI）联合化疗（环磷酰胺+氟达拉滨）的方法彻底清除患者体内的免疫细胞然进行TIL回输，结果显示，化疗+TIL组43例黑色素瘤患者客观缓解率（objective response rate，ORR）为49%，化疗+2Gy TBI+TIL组25例黑色素瘤患者ORR为52%，化疗+12Gy TBI+TIL组25例黑色素瘤患者ORR为72%；3组的CR率分别为12%、20%、40%[16]。这是迄今为止报道的疗效最显著的过继免疫治疗方法。但在接受12Gy TBI组中约1/3的患者会出现血栓性微血管病变的并发症，发生时间多在接受治疗后的4～12个月[17]。该不良反应也应引起关注。有研究显示，TIL在转移性恶性黑色素瘤治疗中的ORR为50%，CR约20%，当然，由于TIL细胞制备的特殊性，深入该领域的研究团队相对较少，该领域内的研究尚缺乏令人信服的设计合理的大样本多中心随机临床研究，但是这并不妨碍有条件的医疗机构去做更多有益的尝试。最新临床研究还提示：肢端、黏膜或BRAF突变的患者更能通过TIL治疗获益，既往使用过免疫检查点抑制剂的患者疗效欠佳。

4.2 基因修饰的T细胞 T细胞受体（TCR）基因修饰的T细胞和嵌合抗原受体修饰的T细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）是当前过继性细胞免疫中两大最新的技术。

TCR基因修饰的T细胞是将运用基因转染技术构建好的肿瘤抗原特异性TCR，通过病毒载体等方法转入T细胞，体外大量扩增后回输患者，进而发挥特异性的抗肿瘤效应。目前研究较多的靶抗原有：纽约食管鳞状细胞癌1（New York oesophageal squamous cell carcinoma-1，NY-ESO-1）、T细胞识别的黑素瘤抗原1（melanoma antigen recognized by T cells 1，MART-1）、黑素瘤抗原A3（melanoma antigen A3，MAGE-A3）和糖蛋白100（glycoprotein 100，gp100）等。第1个针对NYESO-1基因采用TCR基因修饰治疗恶性黑色素瘤的临床试验结果于2011年发表在Journal of Clinical Oncology上。该试验入组了11例黑色素瘤患者，其中5例黑色素瘤患者在治疗后症状改善，2例CR且持续时间1年以上，显示了良好的应用前景[18]。需要指出的是该方法受制于能否获得可特异性识别肿瘤抗原的TCR，既与实验室技术水平相关，也与肿瘤本身抗原表达情况相关，因此很难在黑色素瘤患者群中广泛开展。

CAR-T技术是近年来发展非常迅速的一种过继性细胞免疫治疗技术，在血液肿瘤中已经获得了令人瞩目的成功。该技术是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3ζ或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体，激活其抗原特异性识别能力。目前，CAR的信号域已从第一代的单一信号分子发展为包含CD28、4-1BB等共刺激分子的多信号结构域（第2、3代），并且在进一步发展中。虽然CAR-T治疗在血液系统肿瘤中显示了良好的应用前景，但在实体瘤中，CAR-T的进展仍然十分有限，该技术同样面临肿瘤特异性抗原选择的复杂问题，在黑色瘤中的研究大多也处于临床前研究阶段，以NY-ESO-1抗原为靶点的CAR-T在转移性黑色素瘤患者中观察到了一定的疗效[19]，期待更有说服力的临床研究结果。另外，在CAR-T的治疗过程中，也出现了严重的不良反应，如细胞因子风暴，表现为低血压、呼吸困难、谵妄、神经毒性等，严重者导致患者死亡，或者需要重症监护，应引起重视。

5 免疫检查点抑制剂

免疫检查点疗法是一类通过调节T细胞活性来提高抗肿瘤免疫反应的治疗方法。所谓的免疫检查点其实是免疫系统中的抑制性通路，它们本来的作用是为了避免自身过度免疫，但在肿瘤患者中免疫检查点却与肿瘤的免疫逃逸息息相关。免疫检查点通路由配体/受体相互作用来调控，因此与此相关的蛋白均可成功免疫检查点抑制剂的潜在靶点。细胞毒性淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）是第1个应用于临床的T细胞免疫检查点，其次是程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）与其配体PD-L1。近年来以CTLA-4单抗和PD-1/PDL1单抗为代表的免疫检查点抑制剂在黑色素免疫治疗领域取得了令人鼓舞的研究成果，显示了强大的抗肿瘤效应，体现了良好的应用前景。

CTLA-4主要表达于T细胞表面，是其活性的负性调节蛋白。CTLA-4单抗的作用机制是特异性地结合CTLA-4，阻断其与B7的相互作用，恢复CD28/B7共刺激信号，从而恢复T细胞的免疫活性。目前常见的CTLA-4单抗主要有Ipilimumab和Tremelimumab。

Ipilimumab已经被多项研究证实在一线、一线联合化疗、二线治疗进展期黑色素瘤中具有明确疗效，能显著延长患者的总生存期，Tremelimumab也取得了相似的临床研究结果。一项随机对照Ⅲ期入组了502例初治的进展期恶性黑色素瘤患者，随机分入Ipilimumab+氮烯咪胺组（250例）和Ipilimumab+安慰剂组（252例）。临床试验结果提示：两组5年生存率分别为18.2%、8.8%（P=0.002）。生存曲线平台都出现在治疗的第3年。该研究结果表明Ipilimumab可使晚期黑色素瘤长期获益[20]。正因为其在前述领域的良好表现，Ipilimumab在黑色素瘤辅助治疗中的临床研究被报以很大的期望。Ⅲ期临床结果显示[21]：与安慰剂相比，Ipilimumab可将Ⅲ期或可手术的Ⅳ期恶性黑色素瘤患者的无复发生存率（RFS）提高近9个月（26.1个月vs 17.1个月）；3年RFS为46.5%，与HDI相比提高了4.5%。2015年10月，美国FDA批准Ipilimumab用于治疗Ⅲ期的皮肤黑色素瘤患者的术后辅助治疗,成为近20年来黑色素瘤患者辅助治疗的首个新治疗方法。但是该临床研究中Ipilimumab表现出了较大的不良反应，过高的药物相关性致死事件是辅助治疗的患者无法完全接受的，因此，Ipilimumab想要完全取代HDI成为恶性黑色素瘤术后辅助治疗的最佳选择仍有很长的路要走。

PD-1也主要表达于T细胞表面，也可表达于B细胞及单核细胞表面，是一种抑制性受体，其配体为PDL1和PD-L2（B7-H1和B7-H2）。与配体结合活化后，可导致T细胞失能、耗竭或死亡。PD-1单抗可通过特异性阻断者PD-1的活化，恢复患者T细胞活性发挥抗肿瘤免疫效应。

Nivolumab是美国施贵宝公司研发的IgG4单克隆抗体，2014年获批用于治疗晚期不可切除的黑色素瘤患者，是全球首个获批的PD-1抑制剂。2014年ASCO会议上Hodi教授报道了Ⅰ期临床研究（BMS-936558）数据，对于未接受过Ipilimumab治疗的晚期黑色素瘤患者，ORR达28%，中位无进展生存期（progression free survival，PFS）9.7个月，中位OS为20.3个月，1、2、3年生存率分别为63%、48%和42%。亚组分析发现Nivolumab疗效与肿瘤组织PD-L1表达相关，PD-L1阳性患者中位PFS约9.1个月，显著高于阴性患者的1.9个月，提示肿瘤组织PD-L1的表达可能是预测疗效指标。不良反应主要表现为免疫介导肠炎、肝炎、甲状腺功能异常等，Ⅱ期临床试验显示其免疫相关性不良反应的发生率约为14%，较Ipilimumab25.2%的历史数据明显减轻，其中3～4级不良反应发生率约5%[22]。在刚刚结束的2016年the American Association for Cancer Reseach（AACR）大会上Hodi教授报道了该临床试验长期随访的生存数据，该研究是目前PD-1治疗试验中随访时间最长的研究，4年和5年总生存率分别为35%、34%。生存曲线平台都出现在治疗的3～4年，此时即使停止治疗，治疗反应仍持续存在。因此，持续治疗反应是免疫治疗最惊艳的结果，与靶向和化疗短时间耐药截然不同，免疫系统对肿瘤的治疗作用具有记忆效应，且不会产生耐药性，使人们看到肿瘤治愈的希望。

Pembrolizumab是另外一种PD-1高亲和力的IgG4单克隆抗体。最新研究报道KEYNOTE-001试验655例晚期黑色素瘤患者接受Pembrolizumab治疗长期随访结果，Pembrolizumab表明对晚期恶性黑色素瘤总体有效率可达33%，CR达6%，12个月的PFS率为35%，中位OS为23个月，1年和2年生存率分别为66%、49%。与Nivolumab相似，较Ipilimumab提高约20%，较标准化疗药物DTIC提高约40%。研究还提示Pembrolizumab越早使用可能获得更大受益，一线使用CR高达13.5%，ORR高达45.1%，12个月的PFS为52%，中位 OS为31个月，1年和2年生存率分别为73%、60%。该试验结果确立了Pembrolizumab在一线治疗中的地位[23]。与Nivolumab相似，Pembrolizumab的疗效也与患者肿瘤组织PD-L1表达密切相关，阳性表达是良好的疗效预测指标，但与BRAF突变状况无明显相关性。因此，对于BRAF突变状况不明PD-L1阳性的晚期恶性黑色素瘤患者Pembrolizumab可作为首选药物。Pembrolizumab 3～4级不良反应发生率约 14%，与Nivolumab相似，主要表现为结肠炎（7%）和肝炎（3%）等，但仍相对可控。

PD-L1单抗的作用机制是特异性与PD-L1结合，阻断其与PD-1的相互作用，进而抑制PD-1活化，提高T细胞活性。临床结果提示PD-L1单抗BMS-936559和MPDL3280A在晚期黑色素瘤中ORR分别为17%和26%。由于PD-1存在两个功能配体：PD-L1和PD-L2，所以仅拮抗PD-L1可能无法完全阻断PD-1的活化，这就解释了为什么PD-L1单抗的临床疗效远不及PD-1单抗显著。当然，其不良反应的发生率约9%，相应降低。因不良反应相对较低，有研究者将PD-L1单抗与多个分子靶向药物比如BRAF抑制剂、MEK抑制剂等联合使用，相关的临床试验正在进行中，结果值得期待。

CTLA-4单抗和PD-1单抗那个效果更好？一项Ⅲ期临床试验[24]解答了这个问题，该试验入组834例晚期黑色素瘤患者，按照1∶1∶1随机分为3组：Pembrolizum－ab每2周方案组、Pembrolizumab每3周方案组和Ipilimumab方案组。主要终点是无进展生存期和总体生存期。研究结果显示，6个月无进展生存率分别为47.3%、46.4%和26.5%；12个月总生存率分别为74.1%、74.1%和58.2%；反应率分别为33.7%、32.9%和11.9%，3个指标在Pembrolizumab方案较Ipilimumab方案均获得阳性结果，P＜0.001。3～5级治疗相关的不良事件发生率在Pembrolizumab组较低（分别为13.3%，10.1%），Ipilimumab组19.9%，说明Pembrolizumab在疗效上优于Ipilimumab，且不良反应更低。

虽然单一免疫检查点抑制剂在恶性黑色素瘤治疗领域已经取得了突破性进展，但疗效仍然不十分令人满意。某些研究者将针对不同免疫检查点的两种抑制剂联用，希望能取得更好的治疗效果。一项晚期黑色素瘤一线治疗的临床试验结果提示[25]：Ipilimumab+ Nivolumab组，Ipilimumab+安慰剂组按照2∶1比例入组，ORR分别为61%、11%，CR分别为22%、0。值得关注的是，22%的患者在Ipilimumab和Nivolumab联合治疗后肿瘤CR，这样的结果已经较以往单独使用的疗效有了明显的提高。但不可忽视的是，联合用药带来的严重的不良反应，其3～4级药物相关性不良反应率高达54%，较单药（24%）明显增高。随后的临床试验又进一步证实，Ipilimumab+Nivolumab联合治疗优于两个单抗单用。结果提示：Ipilimumab+Nivolumab联合组、Ipilimumab组、Nivolumab组的PFS分别为11.5、2.9、6.9个月。亚组分析，PD-L1阳性的患者，联合组的PFS是14个月；PD-L1阴性的患者中，联合组的PFS是11.2个月，Opdivo组是5.3个月；3～4级药物相关性不良反应率3组分别为55.0%、27.3%、16.3%[26]。因此，联合用药疗效与风险并存，如何使用还需结合临床实际情况，因地制宜，因人而异。

此外，还有众多针对不同免疫检查点的抑制剂正在进行临床前或者早期的临床研究，例如针对CD40、CD137、OX40、LGA-3、TIM-3等的抑制剂，总的来说取得了一定疗效，具有一定前景，但还没有涌现出类似CTLA-4、PD-1/PD-L1这样疗效确切的靶点。

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2016-04-19）

（本文编辑：马雯娜）

浙江省科技厅公益项目（2014C33119），杭州市科技发展计划项目（20130633B07），杭州市卫生科技项目（2013A02）

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