干细胞体外定向分化为雌性生殖细胞的研究进展

何文 蔡柳洪 文艳飞

干细胞体外定向分化为雌性生殖细胞的研究进展

何文 蔡柳洪 文艳飞

如今女性卵子不足所致不孕的患者日渐增多，却尚无治愈的方法。干细胞作为高度未分化的细胞，其体外定向分化为雌性生殖细胞为治疗这类不孕患者提供了新途径。随着干细胞的研究不断发展，不同来源的干细胞诱导生成雌性生殖细胞的研究也越来越多，目前研究者们能够在体外条件下获得类卵母样细胞，不过其诱导的机制、生物学功能仍需进一步研究探讨。本文对不同来源的干细胞体外定向分化为雌性生殖细胞的研究进行综述，以期为从事该方面的研究者提供一定的借鉴帮助。

胚胎结构； 多能干细胞； 成体干细胞； 生殖细胞

生殖是人类生存延续的永恒主题，随着辅助生殖技术的不断发展，如人工授精、试管婴儿等技术不断成熟，使得越来越多的不孕症患者得到治疗。然而，面对诸如卵巢早衰或卵巢肿瘤手术后等卵巢功能储备低下导致的不孕症患者，辅助生殖技术也无法很好地解决她们的生育问题。干细胞向雌性生殖细胞分化的研究，为这类患者的生育带来新的曙光。将胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）、诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）以及成体干细胞（adult stem cells，ASCs）在体外诱导成为雌性生殖细胞，然后通过体外受精/卵胞质单精子注射-胚胎移植（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperminjection-embryo transfer，IVF/ICSI-ET）技术解决上述患者的生育问题，将为不孕症的治疗开辟一条崭新路径。现将各种干细胞向雌性生殖细胞分化的研究进展综述如下。

一、ESCs向雌性生殖细胞的分化

ESCs是从早期胚胎的内细胞群得到的，具有多向分化潜能并能在体外永久培养的干细胞。ESCs在体内外合适的分化条件下，可以被诱导分化为机体的所有组织器官的细胞，包括生殖细胞［1］。ESCs的来源主要有3种：正常受精囊胚、核移植囊胚及孤雌囊胚。

（一）核移植获得的ESCs与孤雌囊胚获得的ESCs

核移植技术又称为克隆，Tachibana等［2］和Caulfi eld等［3］通过核移植技术获得具有患者体细胞核的ESCs，不过该技术由于伦理问题如所得干细胞带有第三方线粒体基因、相应技术仍未成熟及法律法规所限等原因制约了其发展。通过物理或化学方法激活卵母细胞，可引起卵裂和胚胎发育从而获得孤雌囊胚，目前已有报道人孤雌ESCs系建立，并证实其拥有与人正常受精囊胚来源ESCs相似的增殖与分化潜能［4］。2015年我国单智焱等［5］建立了ESCs来源的iPSCs，重新修饰了印记基因的表达，降低了孤雌ESCs的基因印记风险，获得了更加接近正常受精囊胚来源ESCs的印记基因表达。虽然人们已获得了包括人在内的多种孤雌激活ESCs，但其构建效率低，研究者们对其生物学特性、分化可塑性等研究甚少，因此，本文主要讨论正常受精囊胚来源ESCs向雌性生殖细胞的分化进展［6］。

作者单位：510630 广东，中山大学附属第三医院生殖中心

（二）正常受精囊胚获得的ESCs

目前，ESCs 向生殖细胞诱导分化的常用方法有三种：（1）形成类胚体（embryoid body，EB）后进行单层贴壁诱导；（2）ESCs贴壁培养，添加不同的细胞因子进行单层贴壁诱导；（3）ESCs与间质细胞共培养。另外，可以通过过表达生殖相关特异基因的方法进行诱导［7］。

2003年，德国科学家Hubner等［8］首次在体外将小鼠的ESCs通过绿色荧光蛋白的Oct4启动子筛选后，诱导分化得到卵母样细胞。次年，Clark等［9］将人ESCs通过EBs法诱导得到卵母样细胞。2006年，Lacham-Kaplan等［10］采用EBs法，用新生小鼠睾丸提取液作为条件培养液，将鼠ESCs诱导获得有1 ～ 2层颗粒细胞的卵子样结构。2007年，Qing等［11］采用两步法，先通过EBs诱导获得原始生殖细胞样细胞（primordial germ cells，PGCs），然后将PGCs与颗粒细胞共培养后可检测到卵子特异基因表达，但是未能观察到卵泡样结构。2009年，Yu等［12］将鼠ESCs过表达Dazl得到卵泡样结构。同年，Kee等［13］在单层贴壁诱导基础上，将人ESCs过表达Dazl，Daz及Boule，获得了单倍体配子。2009年，Nicholas等［14］将鼠ESCs通过EBs法诱导，后续添加多种生殖细胞促成熟因子培养，获得了卵母细胞样结构，然后将其移至到鼠肾包膜下可以形成原始卵泡样结构。随着研究深入，研究者们发现越来越多的基因可以促进诱导生殖细胞生成，过表达Vasa及Stella均可以促进人ESCs向生殖细胞分化［15-16］。2013年Hayashi等［17］首次报道利用鼠ESCs在体外用BMP4等诱导分化为PGCs，然后将PGCs与雌性胚胎性腺细胞共培养，培养所得细胞团再移植于小鼠卵巢包膜下，最终获得胚泡期卵母细胞，所得卵母细胞经体外成熟，并通过IVF技术后获得健康且具有生育能力的后代。2014年，我国科学家Wan等［18］用维甲酸（retinoic acid，RA）和齐墩果酸诱导鼠ESCs向PGCs分化，发现Gdf-9、Stra、Scp3、Zp1等标记物表达上调，研究结果提示齐墩果酸可以单独作为诱导因子用于PGCs的诱导。同年，Chen等［19］用颗粒细胞共培养同时添加RA处理的方法，可以提高PGCs的诱导效率，不过成熟卵母细胞标记物Zp3的表达却有所降低。2016年，我国科学家Zhou等［20］首次报道完全在体外培养的条件下获得了功能性精子，其研究团队先将鼠ESCs在体外诱导为PGCs，然后与胎鼠睾丸细胞共培养后序贯添加细胞因子（Activin A，BMRs以及RA）和性激素（FSH、T以及牛脑垂体提取物），得到减数分裂的精子，并用IVF-ET技术获得了健康且具有生育能力的后代。至今为止，仍未有研究报道能在纯粹体外培养的条件下将ESCs诱导为成熟卵细胞，不过，ESCs在纯体外培养下获得了功能性精子为将来研究诱导雌性生殖细胞提供借鉴。

综上所述，研究者们发现了可以通过过表达诸如Dazl、Vasa等基因促进ESCs向PGCs的分化，同时发展改进了体外培养体系，发现添加如RA、BMP4等因子能有效地上调诱导的效率。但是至今为止ESCs在纯粹体外环境下诱导，不管是通过何种诱导方式，研究者们只能获得类卵母细胞，而不能获得成熟的卵细胞。诱导所得的类卵母细胞的特征以及功能仍不确定，诱导分化的相关机制仍没未清楚，以及如何在体外环境下诱导有功能的成熟卵细胞等仍需要大量的后续研究。

二、iPSCs向雌性生殖细胞的分化

iPSCs是通过外源导入基因或转录因子等方法，诱导已分化的成熟的体细胞重编程为具有ESCs性质、有多向分化潜能的细胞。2006年日本Yamanaka等［21］将4个转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4通过反转录病毒载体转入小鼠的成纤维细胞，诱导成多功能干细胞。次年，Yamanaka等［22］成功建立了人iPSCs株。2009年，我国科学家Zhao等［23］利用iPSCs注射四倍体小鼠胚胎，成功获得了活体小鼠后代，首次证实了iPSCs的生殖潜能。iPSCs具有取材来源方便、不发生免疫排斥反应以及无伦理道德争议等优势，是治疗雌性配子缺乏导致女性不孕症患者的理想的种子细胞。

iPSCs体外向雌性生殖细胞诱导分化的常用方法有两种：（1）过表达某些生殖细胞相关基因法；（2）在体外模拟生殖细胞分化所需的内环境诱导法［24］。

2009年Park等［25］通过将皮肤成纤维细胞来源的iPSCs与性腺细胞共培养的方法，诱导其向PGCs分化，可以检测到Stella、Vasa表达。同年，Kim等［26］借鉴Hubner的实验方案，将神经干细胞来源的iPSCs诱导为PGCs，观察到Gdf9、Sycp3以及PGC早期标记物如Blimp1、Stella等表达增高。2010年，日本科学家Imamura等［27］构建了人肝细胞来源的iPSCs，用无LIF的培养基培养，得到Vasa表达阳性的PGCs，并且如果采用EB法培养的话，可在EB团的边缘发现有Oct4-/Vasa+的类卵母细胞样细胞。Imamura研究发现，将iPSCs与可以表达BMP4、GDFN、SCF等因子的细胞共培养，可以促进iPSCs往生殖细胞分化。2011年，Panula等［28］将胎儿皮肤细胞和成体皮肤细胞来源的iPSCs体外诱导分化，添加BMP4、BMP7、BMP8b培养的方法，获得了5%的PGCs诱导成功率，比ESCs的诱导率高。同年，Eguizabal等［29］用人iPSCs先用常规的细胞因子培养，然后RA培养，之后将表达LIF、bFGF、FRSK以及CYP26的细胞筛选出来再培养一段时间后，检测到PGCs表面标志物阳性以及有单倍体细胞形成。2012年，Hayashi等［30］用小鼠成纤维细胞构建iPSCs，用Pou5f1及EGF诱导成类原始生殖细胞（PGC-like cells，PGCLCs），然后将其与内源性的PGCs形成的“再建卵巢”共培养，所得细胞表现出有减数分裂潜能，如果将所得的PGCLCs移植入鼠的卵泡囊中，可以获得生发泡期卵母细胞，并且经过体外成熟以及体外受精技术可以得到2PN的胚胎。2012年Medrano等［15］采用过表达Vasa/Dazl，可以促进人iPSCs向PGCs的分化以及成熟，可以促进其下一步的减数分裂，并且可以观察到有卵泡样结构细胞形成。次年Niu等［31］先将iPSCs培养为EBs，然后添加RA、猪卵泡液培养得到类卵母细胞。2014年Medrano等［32］将人iPSCs用含有猪皮凝胶的培养基进行诱导，可检测Vasa、SCP3等多种生殖细胞标记物呈表达，并可在镜下观察到类卵母细胞样结构。2015年，Anchan等［33］通过检测人卵巢性腺组织来源的iPSCs，发现其表达的卵巢标记物（AMHR、FSHR、P450等）和早期配子标记物（Myh、Dazl、Gdf9等）较其他细胞系来源的iPSCs多，该实验表明用目标组织来源的iPSCs进行目标组织的诱导会更有优势。同年Leng等［34］将卵巢早衰患者皮肤成纤维细胞来源的 iPSCs在添加BMP4和Wnt3a诱导其向PGCs分化，得到PGCs，但在该体系下不能诱导进行减数分裂。2016年，文艳飞等［35］用卵巢早衰患者外周单核细胞来源构建的iPSCs在体外用TGF-β以及BMP4进行诱导分化，检测到c-Kit、Stella、Vasa等表达上调，表明卵巢早衰患者单核细胞iPSCs能向PGCs分化。

从iPSCs出现以来，科学家们不断尝试将iPSCs往生殖细胞诱导分化方向努力，大量的实验结果提示iPSCs具有向雌性生殖细胞分化的潜能。不过，尚未有实验报道iPSCs在完全体外分化所得的卵母细胞/类卵母细胞样细胞具有排卵以及受精能力。并且，iPSCs往PGCs分化的方案如添加的细胞因子种类、剂量、时间等均未有同一的共识。2016年体外将ESCs诱导获得功能性精子给研究者们将iPSCs往雌性生殖细胞诱导信心，继续完善体外卵母细胞生长发育的内环境模拟或许是一个可行的研究方向。总而言之，如何提高分化效率、促进PGCs的成熟以及获得功能性卵母细胞仍需人们不断的实验。

三、ASCs向雌性生殖细胞的分化

ASCs是存在于已分化的组织和器官中，具有和ESCs一样能够自我更新能力，并能分化成本组织来源的未分化细胞。ASCs在体内多数处于休眠状态并且能够维持其多能性，在一定条件下其能够自我更新且能分化为该组织的细胞类型，同时实验表明，ASCs能表现出多向分化潜能，包括分化为成骨细胞、软骨细胞等［36］。ASCs具有取材方便，临床应用无免疫排斥及伦理顾虑等优势，因此，ASCs也是雌性生殖细胞体外诱导的理想来源之一［37］。

（一）雌性生殖干细胞（female germline stem cells，FGSCs）

一直以来，都认为雌性哺乳动物生后具有的卵母细胞数量是固定的，并且随着年龄增加而不断减少。不过，2004年Johnson等［38］在鼠卵巢皮质发现除卵母细胞之外，存在BrdU+和Vasa+的细胞，首次提出卵巢上皮存在干细胞的观点。2009年，我国科学家Zou等［39］从鼠卵巢中分离出表达PGCs特异标志分子但不表达减数分裂标志基因和卵母细胞表达基因的类PGCs细胞，并将其移植入生殖缺陷模型小鼠体内，成功获得了后代。2012年White等［40］重复Zou等在小鼠上的实验，他们用类似的方法从成年女性的卵巢皮层中也成功分离了FGSCs，体外培养后能形成卵细胞样细胞，植入免疫缺陷鼠内能产生卵母细胞。次年，Viran等［41］用SSEA-4蛋白筛选，从人卵巢分离出FGSCs，检测其能表达Vasa、DPPA以及PRDM1等早期生殖细胞相关的标记基因，但不表达减数分裂相关基因。研究者们发现卵巢上皮存在的干细胞，又称微小胚胎样细胞，可以在体外不添加任何细胞因子的条件下自行分化为卵母样细胞，但是其分化增殖能力有限［42］。近年来科学家们对从FGSCs的体外培养以及体外成熟的研究进展火热，不过仍然没有一个很好的培养体系在体外将FGSCs诱导为成熟且有功能的卵母细胞［43］。随着研究的深入，FGSCs将为重建女性生育能力提供一个新的策略和研究方向。

（二）其他ASCs

对于卵巢缺失所致不孕的人群，来自其他组织的ASCs也可以成为其配子的潜在来源。2005年，Johnson等［44］报道骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）有可能诱导为雌性生殖细胞，后续的研究显示，不同性别来源的BMSCs分化过程有所不同，雌性BMSCs更容易分化为雌性PGCs，而在BMSCs往生殖细胞诱导的研究中，BMSCs向雄性PGCs的研究更为深入，往雌性PGCs分化的研究则需要研究者日后更多的努力［45-46］。2006年加拿大科学家Dyce等［47］用猪皮肤干细胞添加猪卵泡液、FSH以及LH的方法进行诱导，获得了卵母样细胞，并检测到雌孕激素分泌，但是该卵母样细胞仍不具生理功能。2007年Danner等［48］将胰脏干细胞体外培养，发现能诱导得到具有立体结构的类卵母样细胞，并能表达Vasa、GDF9、SSEA1、SCP3等生殖细胞特异基因及减数分裂基因。2014年我国Yu等［49］将人羊水干细胞用含猪卵泡液的培养体系在体外诱导得到的PGCs表达Vasa、BMP15等，并且该PGCs可观察到原始卵泡、次级卵泡及卵丘卵母细胞样复合体形成，同时可以发生减数分裂形成单倍体细胞。

虽然关于ASCs往雌性生殖细胞分化的研究在世界范围内如火如荼地进行，不过，现在仍未有由ASCs诱导得到的卵母细胞/类卵母样细胞具有排卵、受精及产生后代等能力的报道。ASCs可塑性并不比ESCs、iPSCs差，在ESCs以及iPSCs的研究中的方案可以在ASCs上探索，横向的研究有利于各种干细胞诱导方案的改善，如可以对ASCs进行生殖细胞基因的过表达等方式诱导。因此，需要更多后续研究去探索ASCs的分化机制及生物学特性，完善其体外培养、诱导的方法和条件，以便日后更好地为配子缺乏的女性不孕症患者服务。

四、展望

综上所述，近10余年来研究者们对干细胞向雌性生殖细胞分化的研究不断深入，从不同的干细胞来源（ESCs、iPSCs、ASCs），不同的体外培养体系、诱导方法都进行了大量的探索。但是，不管哪种类型的干细胞，目前仍然无法在纯粹体外的培养条件下获得具有功能的、进入减数分裂的单倍体卵母细胞，与此同时，干细胞往PGCs诱导的效率非常低。研究者们实现了鼠ESCs与鼠iPSCs诱导所得PGCs通过植入鼠体内后获得了卵母细胞，并孕育了后代，但是鼠PGCs与人PGCs的诱导不能完全等同，如要将该方法复制在人类身上，仍需要后续更多研究支持。2016年研究者们在纯体外条件下获得功能性精子并孕育出健康有生育力后代小鼠，为诱导雌性生殖细胞的研究提供了借鉴。由于ESCs的获取需要从母体内获得卵细胞，在治疗雌性配子缺乏不孕患者时显得有点不切实际。不过，ESCs往卵细胞诱导的研究可以为iPSCs与ASCs提供参考及借鉴。因此，iPSCs与ASCs是更加理想的卵母细胞来源。如何提高干细胞向PGCs诱导效率、PGCs减数分裂的调节以及如何使诱导所得的类卵母细胞具有功能等需要进一步的研究努力。

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（本文编辑：蔡晓珍）

何文， 蔡柳洪， 文艳飞. 干细胞体外定向分化为雌性生殖细胞的研究进展［J/CD］. 中华细胞与干细胞杂志：电子版， 2016，6（4）：243-247.

Research progress of in vitro female germ cells differentiation from pluripotent stem cells

He Wen， Cai Liuhong， Wen Yanfei.

Center for Reproductive Medicine， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Cai Liuhong， Email： cailh@mail.sysu.edu.cn

Nowadays， more and more people suffer from ovum-shortage-induced infertility，but at present there are no effective approaches for treatment. The highly undiff erentiated stem cells，which develop into female germ cells in vitro， hold promising prospects for these infertile patients. The incessant development of the stem cells researches has led to an increasing number of researches in female germ cells derived from different sources of stem cells. Recent findings suggest that oocytelike cells can be generated in vitro. However， its differentiation mechanisms and biological functions still remain unknown and further studies are needed. Now this paper reviews the improvement and innovation of in vitro female germ cells differentiation from pluripotent stem cells，hoping to provide some insights for researches in the future.

Embryonic structures； Multipotent stem cells； Adult stem cells；Germ cells

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.04.009

广东省科技计划项目（2013B021800091）

蔡柳洪，Email：cailh@mail.sysu.edu.cn

（2016-05-26）