急性胰腺炎与自噬及其关键分子Beclin1相关研究进展

2016-01-23 09:20李钦芳湛先保
中华胰腺病杂志 2016年2期
关键词:腺泡溶酶体复合物

李钦芳 湛先保

200433 上海,第二军医大学长海医院消化内科



急性胰腺炎与自噬及其关键分子Beclin1相关研究进展

李钦芳湛先保

200433上海,第二军医大学长海医院消化内科

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是指多种病因引起的胰酶激活,伴有胰腺局部炎症反应,病情较重者可发生全身炎症反应综合症(SIRS),并可并发器官功能障碍[1]。长期以来人们都认为腺泡细胞内胰蛋白酶原的异常活化是AP的主要发病机制。然而进一步研究发现,它只是在AP的病程早期发挥重要作用,而与局部及全身炎症反应密切相关的是早期阶段腺泡细胞内炎症因子活化[2]。随着发病率逐年升高,AP发病机制的相关研究在基础研究领域已成为热点,自噬在胰腺外分泌部的生理功能和AP中发挥着重要的作用,AP发病机制的完善有待于包括对腺泡细胞内自噬、溶酶体功能等在内的深入研究。

一、自噬与胰腺炎

“自噬”一词源于希腊,寓为“自我吞食”,它是将细胞内营养物质循环利用的有效途径,在维持细胞稳态中起着重要作用。自噬至少分为3种类型:巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬,此外还有与巨自噬形态学相似的过氧化物酶体自噬、线粒体自噬等。而通常所说的自噬往往指的是巨自噬。首先,内质网和线粒体形成双层膜结构的隔离膜[3],隔离膜将胞质内的细胞器和蛋白包绕隔离起来形成吞噬泡,吞噬泡边缘的新生膜延伸融合形成双层膜结构的囊泡,即为自噬体。自噬体经历了逐步成熟的过程,包括与酸化的内涵体和(或)溶酶体融合,最终胞质内物质进入溶酶体中融合、降解和重新利用。哺乳动物的自噬过程主要分为起始、成核、延伸、闭合、成熟和降解6个步骤。

胰腺是人体重要的器官,外分泌胰腺的基本生理功能为分泌大量的消化酶包括淀粉酶、脂肪酶和各种蛋白酶。Mizushima等[4]发现胰腺外分泌部的基础自噬水平显著高于肝脏、肾脏、心脏或胰腺内分泌部,并发现自噬可调节胰蛋白酶原颗粒的数量。Gukovskaya等[5]对小鼠离体实验的研究结果也发现在胰腺腺泡细胞中存在大量的生理性自噬。这可能是由于胰腺腺泡细胞内蛋白质代谢旺盛,容易产生错误折叠蛋白的积聚之故。Gukovsky等[6]认为高效的生理性自噬能预防胰腺炎。当敲除自噬相关基因Atg7时,可导致腺泡细胞萎缩退化,胰腺纤维化,继而引发慢性胰腺炎(CP)。

自噬在胰腺炎中的作用目前仍存在较多争议。Hashimoto等[7]敲除小鼠自噬相关基因Atg5后并未观察到胰腺炎的表型,但胰蛋白酶原活性下降,从而认为自噬是胰腺炎危险因素,在AP早期自噬可通过溶酶体机制活化胰蛋白酶原。 但Grasso等[8]则认为选择性自噬是胰腺炎的保护因素,能在胰腺炎早期清除异常活化的胰蛋白酶原。而最新的实验证据表明,至少在小鼠中,自噬障碍能导致胰腺炎的发生[9-11]。Gukovsky等[12]在胰腺炎相关的体内外实验中发现,胰腺腺泡细胞中存在溶酶体和线粒体等重要细胞器的功能障碍。自噬是一个动态的过程即自噬流(autophagic flux),包括自噬体的形成、自噬体底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程。自噬体只是自噬流过程中的一个中间产物,仅仅以自噬体数量来反映自噬强弱并不准确。AP时溶酶体功能障碍导致自噬流不畅,引起溶酶体相关的自噬障碍。有观点认为胰腺炎时的溶酶体功能障碍是由组织蛋白酶(包括组织蛋白酶B和组织蛋白酶D等)和大部分溶酶体水解酶成熟和活化异常引起。也有观点认为是由于胰腺炎中溶酶体膜蛋白LAMP-1和LAMP-2下降所致。溶酶体功能障碍在胰腺炎的早期起着重要的促进炎症发生和进展的作用。自噬受损导致腺泡细胞中空泡堆积;组织蛋白酶成熟及活化异常导致腺泡细胞内活化的胰蛋白酶原颗粒堆积,胰蛋白酶异常活化的升高是胰腺炎的重要标志;而LAMP-2缺乏导致炎症和腺泡细胞坏死。因此,自噬和溶酶体功能障碍在胰腺炎中起着重要作用。另外,线粒体受损促进自噬,使溶酶体负荷增加,从而进一步导致溶酶体功能受损。因此,溶酶体和线粒体功能不全都可通过影响细胞的自噬功能,从而在胰腺炎的发生过程中起着促进作用。而自噬功能不全导致胰腺炎的机制尚待阐明。

二、Beclin1在自噬中的作用

自噬往往依赖于Atg5和Atg7基因,Atg5/Atg7依赖性自噬与微管相关蛋白轻链3(LC3)的切断和脂化有关。然而Atg5/Atg7敲除的细胞仍可见自噬体,却无LC3的表达,说明Atg5/Atg7非依赖性的自噬通路与LC3无关,但参与了晚期内涵体和转运高尔基体源性的自噬体的形成。值得一提的是,无论是Atg5/Atg7依赖性还是非依赖性的自噬均需要Beclin1的参与[13]。Beclin1是酵母自噬基因Atg6/Vps30在哺乳动物中的同源类似物。1998年Liang等[14]发现Bcl-2为Sindbis病毒性脑炎的保护性因素,于是运用酵母双杂交系统研究与Bcl-2相互作用的因子时发现在荧光共振能量转移显微镜下有一个分子量为60 000的新型蛋白,即Beclin1。Beclin1主要存在于胞质中,形态卷曲,包含BH3、CCD与ECD 3种结构域,这些结构域可以与多种蛋白相互作用,参与自噬和凋亡的调节。通过ECD结构域,Beclin1与PtdIns3KC3结合,使其磷酸化为有活性的PtdIns(3)P,然后与Atg蛋白相互作用,参与自噬体的形成;Beclin1通过CCD和BH3结构域相互聚合形成寡聚体,参与一些自噬因子的活化,从而起到正向调节自噬作用。酵母及哺乳动物中均存在两种稳定的Beclin1复合体。Atg6/Beclin 1、Vps34/PtdIns3KC3和Vps15/p150(后者是PtdIns3KC3的蛋白调节激酶)形成复合体,并在此基础上与不同的蛋白相互结合,在自噬的不同阶段中发挥作用。一方面,该复合体与Atg14或其哺乳动物的同源物质Atg14L(又名Barkor)结合,称为复合物Ⅰ,在Atg14或Atg14L引导下,参与自噬前体结构(PAS)的形成。另一方面,该复合体与Vps38或其哺乳动物的同源物质UVRAG结合,称为复合物Ⅱ,在酵母中参与液泡蛋白的分选,但在哺乳动物中该复合物是否参与自噬体的形成仍有争议。近年研究的结果倾向于复合物Ⅱ与自噬无关,而最新研究则认为复合物Ⅱ参与胞内物质的降解和细胞分裂过程。在鼠类巨噬细胞和线虫中发现Beclin1参与细胞的内吞作用和蛋白分选,但是否需要UVRAG的参与还有待进一步研究。此外,与Beclin1相互作用的蛋白还有Ambra1、Bif-1、Rubicon和Bcl-2。这些分子抑或是这两种复合物的抑制因子,抑或是促进因子,参与自噬的调节,其调节作用多为一过性,在特定的病理或生理情况下参与复合物Ⅰ及Ⅱ的调节[15]。如Bcl-2通过与Beclin1的BH3结构域结合可以抑制自噬的发生。而一旦Bcl-2或Beclin1磷酸化,或者Beclin1泛素化,二者的结合将受影响,使Beclin1从Bcl-2/Bcl-XL上解离下来,促进自噬的产生。

三、Beclin1与急性胰腺炎

Beclin1与胰腺疾病间的关系尚不明了。较为肯定的是沉默Beclin1可以促进胰腺癌细胞的自噬及降低吉西他滨诱导的凋亡,换而言之,Beclin1可以抑制胰腺癌细胞的自噬,促进凋亡[16]。Beclin1在AP中的作用研究很少。Zhang等[17]注射雨蛙素(10或50 μg/kg)至雄性小鼠的腹腔内。采用免疫组化技术发现正常对照组Beclin1散在于腺泡细胞胞质中,包括内质网和非特异性区域;10 μg/kg雨蛙素造模组的Beclin1聚集于腺泡细胞中央位置,总量稍有减少;50 μg/kg雨蛙素造模组的Beclin1浓聚于大的自噬体和小的自噬泡中,但总量骤降。蛋白印迹法提示雨蛙素造模后Beclin1总量明显降低。免疫共定位技术观察到VMP1、Beclin1、LC3共同位于自噬体膜上,提示这些蛋白可能相互作用诱导自噬的产生。免疫细胞化学和蛋白印迹法检测均发现在雨蛙素诱导的胰腺炎中Beclin1表达下调,提示细胞内存在Beclin1的消耗或者其他未知作用机制存在。在雨蛙素诱导的小鼠AP模型中,Beclin1的下调程度与雨蛙素剂量成正相关。Miller等[18]认为VMP1是自噬相关膜蛋白,它参与雨蛙素诱导的AP时细胞的自噬的形成。近期研究发现,VMP1通过与Beclin1的BH3结构域相互作用调节胰腺细胞中自噬体的形成。在人体细胞中,它可以使Beclin1-hVps34复合体聚集,从而调节自噬体的形成。Miller等[18]还发现,VMP1的Atg结构域与Beclin1-BH3的亲和力大于Beclin1与Bcl-2的亲和力,可以使Beclin1与Bcl-2解离,促进自噬的产生。VMP1-Atg也参与Ⅲ型PI3K复合物的形成,并且在自噬中有协同作用。此外,VMP1-Beclin1-hVps34复合物还参与LC3的形成。Mareninova等[19]采用蛋白质印迹法检测到雨蛙素诱导的AP大鼠Beclin1表达上调,提示AP时Beclin1相关的自噬增加。尽管迄今研究结果不一,但可见Beclin1与雨蛙素诱导的AP的自噬有关。

综上所述,自噬是AP发生过程重要的病理现象,自噬流障碍参与了胰蛋白酶原的活化和AP的发生。自噬启动的关键分子Beclin1在AP发生中的变化研究结果尚不一致,其病理生理意义也不明了。进一步深入研究将有助于阐明AP时自噬的发生机制,不仅有助于深入揭示AP的发生机制,甚至有助于探索AP的治疗方法和靶点。

参考文献

[1]中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组,《中华胰腺病杂志》编辑委员会,《中华消化杂志》编辑委员会. 中国急性胰腺炎诊治指南(2013,上海). 中华胰腺病杂志, 2013,13:110-112.DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.001.DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.001.

[2]Kaufmann A, Rossler OG, Thiel G. Expression of the transcription factor Egr-1 in pancreatic acinar cells following stimulation of cholecystokinin or Galphaq-coupled designer receptors[J]. Cell Physiol Biochem, 2014,33(5):1411-1125.DOI:10.1159/000358707.

[3]Tooze SA, Yoshimori T. The origin of the autophagosomal membrane[J]. Nat Cell Biol, 2010,12(9):831-835.DOI:10.1038/ncb0910-831.

[4]Mizushima N, Yamamoto A, Matsui M, et al. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker[J]. Mol Biol Cell, 2004,15(3):1101-1111.DOI:10.1091/mbc.E03-09-0704.

[5]Gukovskaya AS, Gukovsky I. Autophagy and pancreatitis[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012,303(9):G993-G1003.DOI:10.1152/ajpgi.00122.2012.

[6]Gukovsky I, Li N, Todoric J, et al. Inflammation, autophagy, and obesity: common features in the pathogenesis of pancreatitis and pancreatic cancer[J]. Gastroenterology, 2013,144(6):1199-1209.DOI:10.1053/j.gastro.2013.02.007.

[7]Hashimoto D, Ohmuraya M, Hirota M, et al. Involvement of autophagy in trypsinogen activation within the pancreatic acinar cells[J]. J Cell Biol, 2008,181(7):1065-1072.DOI:10.1083/jcb.200712156.

[8]Grasso D, Ropolo A, Lo Re A, et al. Zymophagy, a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death[J]. J Biol Chem, 2011,286(10):8308-8024.DOI:10.1074/jbc.M110.197301.

[9]Li N, Wu X, Holzer RG, et al. Loss of acinar cell IKKalpha triggers spontaneous pancreatitis in mice[J]. J Clin Invest, 2013,123(5):2231-2243.DOI:10.1172/jci64498.

[10]Diakopoulos KN, Lesina M, Wormann S, et al. Impaired autophagy induces chronic atrophic pancreatitis in mice via sex- and nutrition-dependent processes[J]. Gastroenterology, 2015,148(3):626-638.DOI:10.1053/j.gastro.2014.12.003.

[11]Gukovsky I, Gukovskaya AS. Impaired autophagy triggers chronic pancreatitis: lessons from pancreas-specific atg5 knockout mice[J]. Gastroenterology, 2015, 148(3):501-505.DOI:10.1053/j.gastro.2015.01.012.

[12]Gukovsky I, Pandol SJ, Mareninova OA, et al. Impaired autophagy and organellar dysfunction in pancreatitis[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2012,27 Suppl 2:27-32.DOI:10.1111/j.1440-1746.2011.07004.x.

[13]Nishida Y, Arakawa S, Fujitani K, et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy[J]. Nature, 2009,461(7264):654-658.DOI:10.1038/nature08455.

[14]Liang XH, Kleeman LK, Jiang HH, et al. Protection against fatal Sindbis virus encephalitis by beclin, a novel Bcl-2-interacting protein[J]. J Virol, 1998,72(11):8586-8596.

[15]曹大龙, 刘黎明. RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究进展[J]. 医学综述, 2015,14:2546-2569.DOI:10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.026.DOI:10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.026.

[16]Li X, Yan J, Wang L, et al. Beclin1 inhibition promotes autophagy and decreases gemcitabine-induced apoptosis in Miapaca2 pancreatic cancer cells[J]. Cancer Cell Int, 2013,13(1):26.DOI:10.1186/1475-2867-13-26.

[17]Zhang L, Zhang J, Shea K, et al. Autophagy in pancreatic acinar cells in caerulein-treated mice: immunolocalization of related proteins and their potential as markers of pancreatitis[J]. Toxicol Pathol, 2014, 42(2):435-457.DOI:10.1177/0192623313486967.

[18]Miller KJ, Raulefs S, Kong B, et al. Loss of ifnar1 in pancreatic acinar cells ameliorates the disease course of acute pancreatitis[J]. PLoS One, 2015,10(11):e0143735.DOI:10.1371/journal.pone.0143735.

[19]Mareninova OA, Hermann K, French SW, et al. Impaired autophagic flux mediates acinar cell vacuole formation and trypsinogen activation in rodent models of acute pancreatitis[J]. J Clin Invest, 2009,119(11):3340-3355.DOI:10.1172/jci38674.

(本文编辑:屠振兴)

(收稿日期:2015-12-07)

通信作者:湛先保,Email: zhanxianbao@126.com

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.02.018

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