UPLC-MS/MS 法测定比格犬血浆中双氯芬酸钠的浓度

向志雄刘文丽（上海医药集团股份有限公司中央研究院 上海 201203）

UPLC-MS/MS 法测定比格犬血浆中双氯芬酸钠的浓度

向志雄*刘文丽
（上海医药集团股份有限公司中央研究院 上海 201203）

摘 要目的：建立灵敏的超高效液相色谱-质谱联用法测定比格犬血浆中的双氯芬酸钠的浓度。方法：选用BEH C18（2.1 mm×100 mm, 1.7 mm）色谱柱，以乙腈-醋酸铵（2 mmol·L-1）-甲酸（70∶30∶0.1，v/v/v）为流动相，采用等度洗脱进行分离，样品采用含0.1% 甲酸的乙腈进行蛋白沉淀后进样，通过电喷雾电离源, 以多重反应监测（MRM）方式进行负离子检测, 用于定量分析的离子对为m/z （293.9+293.9+296.1）→（249.9+213.7+251.8） (双氯芬酸)和m/z 283.0→239.0（内标, 大黄酸）测定双氯芬酸钠。结果：双氯芬酸钠的线性范围为：1.0 ~ 3 000.0 ng·ml-1；定量下限可达1.0 ng·ml-1；日内、日间精密度（RSD）均小于15 %。结论: 本方法同时选择3个碎片离子作为双氯芬酸钠定量产物离子，明显的改进了分析方法的灵敏度, 血浆用量少,适用于比格犬血浆样品中双氯芬酸钠的测定和药物动力学研究。

关键词超高效液相色谱-质谱联用法 双氯芬酸钠 比格犬血浆样品检测 血药浓度

文献标示码：A

UPLC-MS/MS determination of the diclofenac sodium (DS) in dog plasma

XIANG Zhixiong*, LIU Wenli
(Central Research Institute, Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd., Shanghai 201203, China)

ABSTRACTObjective: To develop a UPLC-MS/MS method for determination of diclofenac sodium (DS) in dog plasma. Methods: DS and internal standard were extracted from plasma by acetonitrile containing 0.1% formic acid and separated on a column BEH C18（2.1 mm×100 mm, 1.7 mm）using acetonitrile-ammonium acetate (2 mmol·L-1)-formic acid (0.1%) (70∶30∶0.1, v/v/v) as a mobile phase. A tandem mass spectrometer equipped with electrospray ionization source was adopted as a detector. Multiple reaction monitoring (MRM) transitions of m/z (293.9+293.9+296.1) →(249.9+213.7+251.8), m/z 283.0→239.0 were measured in negative mode for DS and internal standard rhein, respectively. Results: The calibration curve for DS was linear over the range of 1.0~3 000.0 ng·ml-1and the lower limit of quantification was 1.0 ng·ml-1with the relative standard deviation of intra-day and inter-day over the entire concentration range less than 15%. Conclusion: This method is sensitive and suitable for pharmacokinetic study of DS in dog subjects.

KEY WORDSUPLC-MS/MS; diclofenac sodium; Beagle dog plasma sample testing; plasma concentration

双氯芬酸钠双释放肠溶胶囊（diclofenac sodium，DS）是一种非甾体抗炎药，它具有独特的双释放系统，主要通过抑制前列腺素合成而发挥抗风湿、消炎、镇痛及解热作用。临床上常用于类风湿性关节炎、肌腱炎、骨关节炎、滑囊炎及其他关节或关节周围疾患的消炎及镇痛[1]。有关双氯芬酸钠血药浓度的测定方法，国内外报道主要有 HPLC-UV、GC、LC-MS、LC-MS/MS 和UPLC-MS/MS法[2-8]，分析时间较长，前处理方法有蛋白沉淀、液-液萃取、固相萃取，血浆需求量一般比较大（0.1~2.0 ml），灵敏度较低（2.5～80 ng·ml-1）。有关比格犬血浆中双氯芬酸钠的超高效液相色谱-质谱联用测定方法，尚未见文献报道，仅有一篇关于兔血浆中双氯芬酸钠的超高效液相色谱-质谱联用测定的报道[8]。本实验拟建立快速、灵敏、专属性强的UPLC-MS/MS法，测定比格犬血浆样品中双氯芬酸钠的浓度。

1 仪器与试药

API 4000 QTRAP 型串联质谱仪，配有电喷雾离子化源（ESI）以及Analyst 1.5.1数据处理软件（美国Applied Biosystem 公司）；Waters Acquity UPLC系统，

包括二元输液泵，自动进样器（美国Waters公司）。

双氯芬酸钠标准品（Sigma，批号： 075k1896）；大黄酸标准品（中国药品生物制品检定所，批号： 110757-200206）；乙腈（色谱纯，Merck公司）；醋酸铵（色谱纯，Tedia公司）；甲酸（色谱纯，CNW公司）；其余试剂均为市售分析纯级试剂；实验用水为去离子超纯水；空白Beagle 犬血浆，由复旦大学药学院实验中心提供。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

DS储备液：精密称取双氯芬酸标准品3.21 mg，加1 605 ml 50%甲醇溶液溶解，摇匀，配制成质量浓度为2 000 mg· ml-1的双氯芬酸储备液。

DS标准系列溶液：取DS储备液适量，用乙腈水溶液稀释配制成DS浓度为60，54， 20，6，2，0.6，0.2，0.04，0.02 mg· ml-1的标准溶液。

内标溶液：精密称取大黄酸标准品1.88 mg，加200 ml DMSO溶解并加740 ml 乙腈稀释，摇匀，配制成质量浓度为2 000 mg· ml-1的大黄酸储备液，取适量的大黄酸储备液用含0.1% 甲酸的乙腈稀释到浓度为10.0 ng·ml-1。

2.2 色谱条件

色谱柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 mm，Waters 公司）；流动相：乙腈-2 mmol·L-1醋酸铵-甲酸（70∶30∶0.1，v/v/v）；流速：0.3 ml·min-1；分析时间：2 min; 柱温：25 ℃；自动进样器温度：4 ℃；进样量：5 ml。

2.3 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）， 负离子方式检测；离子源电压（IS）： -4 500 V； 离子源温度（TEM）： 500℃；雾化气（Gas 1，N2）压力： 345 kPa；辅助气（Gas 2，N2）压力： 345 kPa；气帘气（CUR） 压力： 138 kPa；扫描方式为多重反应监测 （MRM）；碰撞气（CAD，N2）压力：Medium；用于定量分析的离子反应分别为m/z （293.9+293.9+296.1）→（249.9+213.7+251.8） （DS，DP电压：-47 V，-47 V ， -53 V ，CE电压：-18 V，-30 V，-15 V；CXP电压：-13 V，-15 V，-15 V），和m/z 283.0→239.0 （大黄酸， DP电压：-80 V，CE电压：-22 V；CXP电压：-17 V）。

2.4 血浆样品处理

精密取血浆样品50 ml至1.5 ml EP管中，加入400 ml内标溶液，混匀后离心10 min（15 200 转/min），取上清液进样5 ml进行UPLC-MS/MS定量分析。

2.5 分析方法确证

2.5.1 质谱分析

将DS储备液用乙腈水稀释到1 μg·ml-1，内标用乙腈稀释到1 μg·ml-1，采用蠕动泵进样模式，分别进行碎片离子分析，相应的二级全扫描质谱图见图1。

图1 二级全扫描质谱图

2.5.2 方法的专属性

分别取空白血浆，加入DS标准溶液和内标溶液的空白血浆，受试动物给药后收集的血浆样品100 ml，按照上述“2.4”项下操作及检测条件进行定量分析，得色谱图2。结果表明：内源性物质不干扰测定。

图2 DS和内标大黄酸的选择离子色谱图

2.5.3 线性关系

取空白血浆190 ml，加入DS标准系列溶液10 ml，配制成相当于血浆浓度为1.0，2.0，10.0，30.0， 100.0，300.0，1 000.0，2 700.0，3 000.0 ng·ml-1标准曲线样品。分别按照“2.4”项下操作后进样分析。以血浆中待测物浓度为横坐标X （ng·ml-1）， 待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标Y，用加权（W =1/X2）最小二乘法进行回归计算，求得DS直线回归方程为：Y=0.030 2X+0.017 4，r =0.997。

根据工作曲线，DS在1.0 ~ 3 000.0 ng·ml-1范围内线形关系良好。DS的定量下限为1.0 ng·ml-1。

2.5.4 准确度与精密度

按“2.4”项下操作，制备DS低、中、高浓度分别为3.0，600.0，2 400.0 ng·ml-1的质量控制（QC）样品，计算方法的准确度与精密度，结果见表1。

表1 血浆中双氯酚酸钠UPLC-MS/MS测定方法的准确度与精密度（n=18）

2.5.5 提取回收率和基质效应

按“2.4”项下操作，制备低、中、高3个浓度的对照品血浆，每个浓度6个样品。同时另外取空白血浆50 ml，加入沉淀剂含0.1% 甲酸的乙腈、混匀后离心10 min （15 200 转/min），向获得的上清液中加入相应浓度的标准溶液和内标溶液，涡流混匀，进样5 ml进行UPLCMS/MS分析，获得相应峰面积，以每一浓度2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率，双氯酚酸钠低、中、高3个浓度的提取回收率±RSD分别为：（85.4±12.2）%，（89.2±8.6）%，（79.0±6.4）%；内标大黄酸的提取回收率为 （86.2±5.4）%。实验中对DS和大黄酸的基质效应进行了考察，结果相对偏差RE均小于15%，表明血浆无明显基质效应存在。

2.5.6 稳定性考察

考察了DS低、中、高浓度分别为3.0、600.0、2 400.0 ng·ml-1在不同条件下的稳定性（n=6）。结果表明：DS室温放置6 h稳定（RE 分别为：14.1%，3.4.%，-5.6%），预处理后自动进样器放置24 h稳定（RE 分别为： 14.0 %，8.8 %，0.3 %），3 次冻融循环稳定（RE 分别为：-5.2 %，-12.6 %，7.6 %），-70 ℃放置24 d稳定（RE 分别为：6.8 %，13.5 %，8.6 %）。

2.5.7 稀释效应验证试验

本方法中DS的线性范围为1.0 ~ 3 000.0 ng·ml-1，对于浓度超出线性范围的样品，用空白比格犬血浆稀释后再测定，因此进行了稀释效应验证试验。配制DS浓度为24 000 ng/ml的6份血浆样品，精密吸取5 ml，加入空白血浆45 ml，混匀。按“2.4”项下操作后进样分析，结果准确度为106.7%，RSD=2.42%，表明血浆样品稀释对测定结果没有影响。

2.6 方法学应用

未知血浆样品测定按 “2.4”项下操作，每个分析批

建立一条标准曲线，同时分析低、中、高多样本的质控样品（双氯芬酸血浆浓度分别为3.0，600.0，2 400.0 ng·ml-1），并穿插于受试者样品测定中。根据当批标准曲线求算未知血浆样品浓度和质控样品浓度，至少67 %的质控样品的相对偏差在±15%之内，此批数据方可接收。应用本研究所建立的方法测定8条Beagle犬单剂量灌胃双氯芬酸钠双释放肠溶胶囊（戴芬，规格75 mg/粒）1粒后血药浓度-时间曲线见图3。各受试动物24 h前各点血药浓度均能检测到，本方法可以满足Beagle犬药物动力学研究。

图3 8只比格犬灌胃双氯芬酸钠双释放肠溶胶囊1粒后DS的平均血药浓度-时间曲线

3 讨论

用UPLC-MS/MS测定血药浓度，具有选择性好、灵敏度高、分析时间短等优点，已普遍地应用于药物动力学研究。最新文献报道UPLC-MS/MS法测定兔血浆中双氯芬酸用ESI源，并采用1个响应稳定的主要粹片离子作为双氯芬酸定量分析的产物离子，1个响应稳定的粹片离子作为双氯芬酸钠定性分析的产物离子，但是定量下限只能达80 ng·ml-1[8]。本实验同样选用ESI源，考虑到双氯芬酸钠中含有氯同位素，同时采用3个响应稳定的主要粹片离子作为双氯芬酸定量分析的产物离子，定量下限可达1 ng·ml-1，大大提高了本方法的灵敏度。

分别尝试用甲醇和乙腈作为流动相中的有机相，结果表明后者背景噪音较低，且响应约为前者的两倍，在流动相中加入甲酸和醋酸铵可使待测物的相应增加，峰形得到改善。在有效避免离子抑制与内源性物质干扰的前提下、为了达到更快的分析速度（本实验一个样品分析时间仅2 min），最终选用乙腈-2 mmol·L-1醋酸铵-甲酸（70∶30∶0.1，v/v/v）为流动相，流速为0.3 ml·min-1。与文献[8]比较，本法在流动相都为酸的情况下，当浓度相同时，甲酸比乙酸的响应高，加入缓冲盐，响应更稳定。对比了一些文献应用的内标非那西汀，发现大黄酸在所选用的色谱条件下，不仅峰形好、响应稳定，而且和双氯芬酸钠的保留时间比较接近。

文献报道的双氯芬酸钠血浆样品处理方法有蛋白沉淀法、液-液萃取法、固相萃取法等。固相萃取法成本较高，液-液萃取法比沉淀蛋白处理繁琐，本实验在不影响灵敏度的前提下，采用了同文献[8]相同的蛋白沉淀法，并在优化沉淀条件时，对沉淀试剂进行了考察。血浆样品在不同体积0.1% 甲酸的作为酸化试剂的条件下，分别经甲醇、乙腈溶剂进行沉淀，通过UPLC-MS/MS进行分析，发现以400 ml含0.1% 甲酸的乙腈为沉淀试剂时，提取回收率高且提取稳定。

综上，本研究所建立的方法，分析时间短，实验所需血浆量少，快速、灵敏、专属性强，可用于Beagle犬药物动力学实验，可为双氯芬酸钠的临床药代动力学提供参考。

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收稿日期：（2015-01-05）

作者简介：*向志雄（1978-），男，工程师，主要从事药物分析和药物代谢动力学方面的工作。E-mail: xiangzx@sphchina.com

文章编号：1006-1533(2015)05-0074-04

中图分类号：R969.1; R971.1