亚低温状态下TGF-β 1/Smad2/3通路对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用

亚低温状态下TGF-β1/Smad2/3通路对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用

曾洪艳， 彭宇婕，赵晓姝

(昆明医科大学海源学院,昆明 650000)

摘要：目的探讨TGF-β1/Smad2/3通路在亚低温状态保护大鼠急性脑缺血再灌注损伤的作用。方法选择健康成年雄性SD大鼠30只，制作急性脑缺血再灌注损伤大鼠模型，随机分为假手术组、手术组、亚低温组各10只。亚低温组在亚低温处理1 h后采用干湿法测定各组脑组织含水量，Q-PCR和Western blotting分别检测各组脑组织TGF-β1和p-Smad2/3的基因和蛋白的表达量。结果亚低温组脑组织含水量低于假手术组、手术组(P均<0.05)，而TGF-β1和p-Smad2/3的基因和蛋白的表达量高于假手术组、手术组(P均<0.05)。结论 亚低温能减轻急性脑缺血再灌注损伤引起的急性脑水肿，TGF-β1/Smad2/3信号通路参与了此过程。

关键词：急性脑缺血；再灌注损伤；亚低温；转化生长因子β1；Smad2/3；大鼠

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.41.009

中图分类号：R651.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)41-0025-03

收稿日期：(2015-06-04)

急性脑缺血后5～7 min，细胞能量耗尽，引发急性脑水肿，进一步加剧脑缺血，缺血再灌注使一氧化氮和氧自由基的形成增加，加重神经元损伤。急性脑缺血的处理原则是使血管再通，降低脑代谢，控制脑水肿及保护脑细胞等。亚低温可有效降低脑代谢和控制脑水肿。TGF-β1在急性脑缺血损伤中发挥抗氧化、阻止细胞凋亡、调节炎症反应，调节小胶质细胞和星形胶质细胞反应等多种作用。目前，TGF-β1/Smad2/3通路在亚低温保护急性脑缺血再灌注损伤中的作用机制尚不清楚。2014年11月～2015年6月，我们制作动物模型对此问题进行了研究。

1材料与方法

1.1材料健康成年雄性SD大鼠30只，体质量(280±20)g，购自昆明医科大学动物试验中心，饲养在清洁级动物室，以标准饲料喂养和饮水。水合氯醛(动物实验中心提供)，兔抗大鼠TGF-β1单克隆抗体和兔抗大鼠抗p-Smad2/3单克隆抗体(美国Cell Signaling)，TRIzol Reagent(美国Lifetech)，蛋白酶抑制剂(瑞士Roche)，PVDF膜(美国Miliipore)，电子秤(常州市宏衡电子仪器厂)，PCR扩增仪(德国Eppendoff)，荧光定量PCR仪和凝胶数码成像分析系统(美国BIO-RAD)。

1.2急性脑缺血再灌注损伤模型制备模型制作采用线栓法，以10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，将大鼠以仰卧位固定，行颈部正中切口，分别暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。手术线结扎颈外动脉近心端，在颈内动脉近心端夹一动脉夹，在颈总动脉距分叉3～4 mm处用眼科剪做一斜行的血管切口，将栓线自血管切口处缓缓插入。栓线通过分叉处后，用手术线扎活结将栓线固定于颈内动脉上，松开颈内动脉处的动脉夹，缓慢将栓线沿右侧颈内动脉送至大脑中动脉起始部。起始处深度距颈总动脉血管切口处(20±2)mm，至大脑中动脉遇阻即止，说明栓线已达到大脑中动脉起始部处。阻断大脑中动脉血流，用手术线扎紧固定栓线，结扎固定栓线。缺血1.5 h后，轻轻外拉尼龙线至颈外动脉内恢复再灌注。

1.3动物分组30只SD大鼠完全随机分为3组。假手术组10只除不送入栓线外，其余处理皆同大脑中动脉线栓模型手术。手术组10只急性脑缺血再灌注。亚低温组10只急性脑缺血再灌注后，将冰袋置于大鼠头颈部，调低空调温度，在0.5～1 h内使大鼠体温逐步降低，大鼠肛温控制在32～34 ℃，持续1 h。其余各组以保持大鼠肛温为37 ℃左右。

1.4 脑组织含水量测定亚低温组在亚低温处理1 h后立即断头，各组迅速以冠状切开大脑，去除额极，双侧大脑各取约2 mm厚的脑组织，采用干湿法测定脑含水量，计算公式为：(脑组织湿重-脑组织干重)/湿重×100%。

1.5 脑组织TGF-β1和p-Smad2/3基因和蛋白表达检测各组动物处死后取缺血侧皮层脑组织，置-80 ℃冻存备用。采用Q-PCR检测TGF-β1和p-Smad2/3 mRNA，得到目的基因表达的C(t)值，以2-ΔΔCt进行相对定量分析。采用Western blotting检测TGF-β1和p-Smad2/3蛋白表达，凝胶成像系统扫描图像，所得图片用Image J软件分析灰度值。

1.6统计学方法采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以±s表示，多组数据比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组脑组织含水量假手术组脑组织含水量为(77.26±12.53)%，手术组为(84.73±11.58)%，亚低温组为(81.33±14.63)%。与假手术组相比，手术组和亚低温组脑组织含水量增多(P均<0.05)，亚低温组与手术组比较，亚低温组脑组织含水量有所降低(P<0.05)。

2.2各组脑组织TGF-β1和p-Smad2/3基因表达见表1。

表1　各组脑组织TGF-β 1和p-Smad2/3基因表达( ± s)

表1　各组脑组织TGF-β 1和p-Smad2/3基因表达( ± s)

组别nTGF-β1p-Smad2/3假手术组101.24±0.330.72±0.16手术组100.94±0.35*0.44±0.20*亚低温组101.47±0.32▲0.97±0.34▲

注：与假手术组比较，*P<0.05；与手术组比较，▲P<0.05。

2.3各组脑组织TGF-β1和p-Smad2/3蛋白表达见表2。

表1　各组脑组织TGF-β 1和p-Smad2/3蛋白表达( ± s)

表1　各组脑组织TGF-β 1和p-Smad2/3蛋白表达( ± s)

组别nTGF-β1p-Smad2/3假手术组10126.57±17.95104.68±14.47手术组1083.69±20.63*74.52±16.34*亚低温组10154.70±23.51▲117.25±20.83▲

注：与假手术组比较，*P<0.05；与手术组比较，▲P<0.05。

3讨论

目前，国际医学界将低温划分为轻度低温(33～35 ℃)、中度低温(28～32 ℃)、深低温(17～27 ℃)、超深低温(16～2 ℃)4种[1]，而28～35 ℃轻中度低温定义为亚低温[2]。在低温状态下，由于脑代谢和脑耗氧量的下降使脑组织易于改善和维持氧供需平衡，并减少和抑制多种氧自由基及兴奋性递质的合成与释放，缓解缺血后Na+-K+-ATP酶活性降低而稳定血脑屏障和细胞膜[3，4]，亚低温治疗不但可以减轻颅脑损伤后的病理损害，而且可以促进神经功能恢复[5，6]。亚低温对脑保护可能的保护机制包括：减少兴奋性氨基酸释放，抑制钙离子内流，调节钙调蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶C的活性，抑制脑缺血后的炎性反应，抑制其水肿形成，降低氧代谢率，减少自由基的产生，抑制坏死和线粒体释放细胞色素C诱导神经元凋亡。亚低温脑保护作用的机制，可能涉及到损伤级联中的各个事件，从各个环节影响基因、蛋白质的表达以及转录因子的活性。

TGF-β1通过与下游受体型的Smad2/3，使Smad2/3蛋白C端丝氨酸残基磷酸化[7]，Smad2/3转位到核内，启动转录因子聚合物LEF/TCF，调控相应基因表达，以此产生广泛的生物学效应[8]。TGF-β1可由中枢神经系统中神经元、星型胶质细胞和小胶质细胞产生，从而参与调节神经细胞的生长、分化和凋亡，在多种生理病理过程中起着重要的作用[9]。在生理情况下，大脑的很多区域都不表达TGF-β1，但是在缺血缺氧的情况下，其表达却大幅上调。缺血区TGF-β1表达上调可能的作用有：促血管生成、减弱脑缺血诱发的血管反应、神经保护和抗凋亡。脑室注射TGF-β1能挽救短暂性全脑缺血后海马CA1区锥体神经元损害，与神经营养因子和纤维生长因子相比，只需1/10 000～1/1 000倍的剂量即可显示很强的神经保护效应[10]；对体外培养的海马神经元用TGF-β1进行24 h干预治疗，一氧化氮所致的神经毒性可受到明显抑制[11]。TGF-β1基因敲除的新生小鼠会出现广泛的神经元变性，这些小鼠的神经元在体外培养时存活时间明显缩短[12]。此外，TGF-β1可减轻兴奋性氧基酸、缺氧/缺血损伤以及β-淀粉样肽诱导的神经损伤，从而发挥神经保护作用[13，14]。

本研究发现，亚低温可缓解大鼠急性脑缺血再灌注损伤后急性脑水肿程度，且急性脑缺血再灌注损伤大鼠经亚低温处理后，损伤脑组织中TGF-β1和p-Smad2/3基因和蛋白表达升高，表明亚低温可通过激活TGF-β1/ Smad2/3信号通路，减轻急性脑水肿，对急性脑缺血再灌注损伤脑组织起到保护作用。

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