增强型体外反搏对心脏骤停犬血清一氧化氮系统的影响

刘荣 梁子敬 廖晓星 李欣 胡春林 戴刚 张作鹏 晏平

心脏骤停(cardiac arrest，CA)者经心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation，CPR)恢复自主循环后，由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)生成的一氧化氮(nitric oxide，NO)参与脑缺血/再灌注损伤的发展。NO是一种重要的神经递质，适量的NO具有调节脑血管张力、抑制血小板聚集等保护作用，而过量的NO则有神经毒性作用[1]。其作用的差异依赖于NO的起源，内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)产生的NO有神经保护作用。神经元型NOS(neuronal NOS，nNOS)和诱导型NOS(inducible NOS，iNOS)过度表达所产生的NO有神经毒性作用。NO在脑损伤的病理生理过程中起着重要的作用，如弥漫性脑损伤大鼠脑组织中NO含量和nNOS、iNOS、eNOS的mRNA存在明显时程变化[2]。NO作为神经递质，与CPR后脑缺血/再灌注损伤相关病理生理的发生、发展和预后均密切相关。无创辅助循环装置增强型体外反搏(enhanced external counterpulsation，EECP)是在心脏舒张期序贯地加压于下肢和臀部，驱动血液向心脏返流，产生舒张期增压波。反搏过程中改变了脉动血流方式[3]，增加心脏、脑等组织器官的血液灌流。EECP还可以改善冠心病患者的血管内皮功能[4-5]，对急性心肌梗死犬模型可促进NO的产生，改善其血流动力学[6]。目前尚无EECP对复苏后机体血清nNOS、iNOS和eNOS影响的相关报道。本实验中建立CA犬模型自主循环恢复(return of spontaneous circulation, ROSC) 后应用EECP进行干预，观察EECP对NO、nNOS、iNOS和eNOS的影响，探讨EECP对ROSC后NO系统的具体影响进行。

资料与方法

一、一般资料

选择雄性杂种犬16只，体重10～15 kg，犬龄18～30个月。犬的麻醉、监护、致颤、心肺复苏操作见文献报道的方法[7-8]。以心外膜致颤的方式诱发CA。室颤持续无干预6 min后CPR，ROSC后予重症监护。根据随机数字表法将16只犬分为2组:分别为对照组(8只)和EECP组(8只)。

本实验经实验动物伦理委员会中山大学批准。实验在中山大学卫生部辅助循环重点实验室进行。

二、EECP干预

EECP方法参照文献报道的方法[8-9]。动物取右侧卧位，以0.035～ 0.04 MPa压力反搏。实验犬在ROSC后15 min行EECP各3 h，EECP后继续监护1 h。对照组则不予EECP，其他措施与EECP组相同。观察终点为ROSC后96 h。所有动物分别于CA前基础状态下及ROSC后15 min、4 h、96 h采血并分离血清于-80℃冰箱冻存。

三、血清NO、eNOS、nNOS、iNOS测定

冻存血清解冻，采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(美国,CUSABIO)测定犬血清NO、eNOS、nNOS、iNOS，测定严格按照说明书操作。使用标准规格酶标仪(奥地利,Sunrise，Tecan)在450 nm波长依序测量各孔的吸光度值(A)。

四、统计学分析

结 果

一、EECP组与对照组一般情况比较结果

所有动物均建模成功，EECP干预前，两组犬间体重、肛温、呼吸频率、心率以及CPR至ROSC时间的差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。EECP组所有犬均顺利完成干预。

二、EECP组与对照组血清NO、eNOS、nNOS和iNOS比较结果

基础状态下和ROSC后15 min，两组间血清NO、eNOS、nNOS和iNOS比较，差异无统计学意义(均P>0.05)(表2)。

EECP可升高血清NO水平：ROSC后4 h、96 h，EECP组血清NO含量高于对照组，差异有统计学意义 (P<0.05)(表2)。

表1 EECP组与对照组一般情况比较

注：W为体重，T为肛温，R为呼吸频率，HR为心率，ROSC为心肺复苏至自主循环恢复的时间。EECP组与对照组间分别比较差异无统计学意义，均P> 0.05。

表2 不同时间点下两组血清NO、eNOS、nNOS和iNOS的结果比较

注：NO为一氧化氮、eNOS为内皮型一氧化氮合酶、nNOS 为神经元型一氧化氮合酶、iNOS为诱导型一氧化氮合酶；ROSC为自主循环恢复；a表示与对照组比较P< 0.05，b表示与对照组比较P< 0.01。

EECP可升高血清eNOS水平：ROSC后4 h、96 h，EECP组血清eNOS含量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

CA-ROSC后的一段时间内，血清iNOS水平较基础状态时升高近十倍[(15.90±7.04)U/mL vs (130.34±86.72)U/mL ，(129.88±45.49)U/mL，(110.38±53.69)U/mL]，EECP干预可降低病理状态下的血清iNOS水平：ROSC后4 h、96 h，EECP组血清eNOS含量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

CA-ROSC后机体在缺血/再灌注损伤下细胞内外环境发生重大变化，神经内分泌系统及血清发生一系列病理生理改变，血清NO-NOS系统的改变是众多环节之一。作为无创辅助装置EECP，其治疗可明显增加冠状动脉、脑及各内脏器官的血流灌注。此前已有研究证实EECP可增加缺血性脑梗塞患者的脑血流并改善其脑神经功能[10-11]。本项目前期研究结果已显示，EECP治疗(每天1 h，连续3 d)可增加复苏后比格犬血清NO水平、降低内皮素-1(endothelin-1，ET-1)水平，调整血管舒缩功能，增加CPR后犬模型的脑血流灌注，改善其神经功能[8,12-15]。本研究再次证实EECP治疗(复苏后即行连续EECP 3 h)可升高CA-ROSC模型犬血清NO水平，且EECP对复苏后的初期(15 min)干预，不仅在ROSC后4 h发现有明显上调NO的作用，且该作用可持续长达96 h。这应是EECP对CA后机体整体的良性作用结果，尤其是对增加各重要器官血流、改善微循环所起的积极作用。

此前亦有研究表明[16-17]，吸入NO可通过可溶性鸟苷酸环化酶途径作用，改善复苏后大鼠模型的预后。不同来源的NO(nNOS、iNOS和eNOS)具有各自特有的生理功能，在复苏后的病理生理过程中起到不同的作用。根据本研究两间血清nNOS、iNOS和eNOS的差异可看出，EECP对CA-ROSC模型犬血清NO的上调作用，可能是通过上调eNOS并下调iNOS共同造成的结果。

血流对血管内皮的切应力被认为是内皮细胞释放NO的重要刺激因素，切应力水平与NO的释放呈正相关[18-21]，EECP干预则可明显增加血流切应力[20]。本研究结果显示，EECP组与对照组相比血清eNOS升高，这一变化可能与EECP增加了血流切应力，使血管内皮细胞eNOS蛋白增多、内皮源性的NO生成增加，从而调节重要器官的血流状态有关。

非选择性抑制NOS活性使CPR后血流动力学恶化，选择性抑制iNOS活性也不能改善CPR后的心功能，亦不改善神经功能预后[22]。本研究发现复苏后血清iNOS水平由基础状态的低水平明显升高，说明缺血/再灌注损伤对犬模型的神经毒性作用客观存在。EECP治疗可显著降低CA-ROSC犬血清iNOS水平，提示EECP具有选择性抑制iNOS的神经毒性作用，而适当保留其必要的生理功能。

本研究结果显示，EECP治疗对血清nNOS水平影响无统计学意义，而nNOS在脑缺血损伤、休克时的多器官功能障碍和系统性炎症反应中起到非常重要的毒性作用[23-24]。EECP干预并不增加复苏后nNOS的神经毒性作用，考虑亦是增加血流切应力，选择性对内皮细胞eNOS的良性影响，改善了CA-ROSC后动物模型的脑血流灌注的结果。

EECP用于CA-ROSC后动物模型，可以在一定程度上增加血清NO水平。其对nNOS、iNOS和eNOS的不同影响，主要是一方面作用于与血管内皮功能密切相关的eNOS，增加相应器官血流后改善局部的氧供状态；另一方面抑制iNOS的神经毒性作用。

总之，将EECP早期用于CA-ROSC后存在内皮功能障碍的患者，或可进一步改善重要脏器的血管舒缩功能，增加器官血流而不增加NO的神经毒性，对ROSC后机体产生有利影响，从而改善CA患者的预后。

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